Name: separation of single-stranded dna, double-stranded dna and rna from an environmental viral community using hydroxyapatite chromatography
Uploaded: 2011-09-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography at JoVE.com

מחקר זה מומן על ידי משרד המדע (BER), משרד האנרגיה של ארה&quot;ב, שיתופית הסכם לא. De-FC02-02ER63453, רצף הגנום מיקרוביאלית הקרן הלאומית למדע של התוכנית (מספרים הפרס 0626826 ו 0731916). אנו מודים ג&#39;ון זכוכית עבור המומחיות הטכנית שלו עצות ק &#39;אריק Wommack עזרתו עם אוסף מדגם הסביבה.

1. ההכנה של פתרונות לפני ביצוע כרומטוגרפיה hydroxyapatite, מאגרים פוספט חייב להיות מוכן hydroxyapatite חייב להיות hydrated כראוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון פוספט 1M, pH 6.8: בבקבוק 1 ליטר לפזר 119.98g של פוספט נתרן monobasic ב 1 ליט...

<ol>
	<li>Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokaryotes:+The+Unseen+Majority.">Prokaryotes: The Unseen Majority.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 6578-65 (1998).</li><li>Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophages:+evolution+of+the+majority.">Bacteriophages: evolution of the majority.</a> Theor Popul Biol. 61, 471-471 (2002).</li><li>Weinbauer, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophages:+Evolution+of+the+Majority.">Bacteriophages: Evolution of the Majority.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 127-127 (2004).</li><li>Dinsdale, E. A., Edwards, R. A., Hall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Metabolic+Profiling+of+Nine+Biomes.">Functional Metabolic Profiling of Nine Biomes.</a> Nature. 455, 830-830 (2008).</li><li>McDaniel, L., Breitbart, M., Mobberley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+Analysis+of+Lysogeny+in+Tampa+Bay:+Implications+for+Prophage+Gene+Expression.">Metagenomic Analysis of Lysogeny in Tampa Bay: Implications for Prophage Gene Expression.</a> PLoS ONE. 3, e3263-e3263 (2008).</li><li>Williamson, S. J., Rusch, D. B., Yooseph, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sorcerer+II+Global+Ocean+Sampling+Expedition:+Metagenomic+Characterization+of+Viruses+within+Aquatic+Microbial+Samples.">The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: Metagenomic Characterization of Viruses within Aquatic Microbial Samples.</a> PLoS ONE. 3, e1456-e1456 (2008).</li><li>Lang, A. S., Rise, M. L., Culley, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Viruses+in+the+Sea.">RNA Viruses in the Sea.</a> FEMS Microbiol Rev. 33, 295-295 (2009).</li><li>Ng, T. F., Manire, C., Borrowman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+Novel+Single-Stranded+DNA+Virus+from+a+Sea+Turtle+Fibropapilloma+by+using+Viral+Metagenomics.">Discovery of a Novel Single-Stranded DNA Virus from a Sea Turtle Fibropapilloma by using Viral Metagenomics.</a> J. Virol. 83, 2500-2500 (2009).</li><li>Rosario, K., Duffy, S., Breitbart, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Circovirus-like+Genome+Architectures+Revealed+by+Environmental+Metagenomics.">Diverse Circovirus-like Genome Architectures Revealed by Environmental Metagenomics.</a> J Gen Virol. 90, 2418-2418 (2009).</li><li>Culley, A. I., Lang, A. S., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+Analysis+of+Coastal+RNA+Virus+Communities.">Metagenomic Analysis of Coastal RNA Virus Communities.</a> Science. 312, 1795-1795 (2006).</li><li>Bernardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromotography+of+Nucleic+Acids+on+Hydroxyapatite.">Chromotography of Nucleic Acids on Hydroxyapatite.</a> Nature. 209, 779-779 (1965).</li><li>Andrews-Pfannkoch, C., Fadrosh, D. W., Thorpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyapatite-Mediated+Separation+of+Double-Stranded+DNA,+Single-Stranded+DNA+and+RNA+Genomes+from+Natural+Viral+Assemblages.">Hydroxyapatite-Mediated Separation of Double-Stranded DNA, Single-Stranded DNA and RNA Genomes from Natural Viral Assemblages.</a> Applied and environmental microbiology. 76, 5039-5039 (2010).</li><li>Wommack, K. E., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virioplankton:+Viruses+in+Aquatic+Ecosystems.">Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 64, 69-69 (2000).</li></ol>

המתודולוגיה כרומטוגרפיה hydroxyapatite המוצג כאן הוא כלי יעיל ביותר וחזק עבור חלוקה של חומצות גרעין מ מכלולים ויראלי מעורבת, כאשר המטרה היא ללמוד את הרכב הכולל חומצות גרעין הקהילה. באופן כללי, ssDNA, RNA dsDNA יהיה elute מן הטור פו פוספט בריכוז חיץ גדול יותר כ ~ 0and 0.40M בהתאמה. עם ז?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> חומר שם </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> Econo-טור </td><td> Bio-Rad </td><td> 737-0717 </td><td> 0.7cm חבילת מזהה / 2 </td></tr><tr><td> Hydroxyapatite </td><td> Bio-Rad </td><td> 130-0520 </td><td> ה-DNA כיתה ביו ג&#39;ל ג&#39;ל HTP, 100g/td&gt; </tr><tr><td> נתרן פוספט, Monobasic </td><td> VWR </td><td> VW1497-01 </td><td> מונוהידראט, קריסטל 500 גרם </td></tr><tr><td> נתרן פוספט, Dibasic </td><td> VWR </td><td> VW1496-01 </td><td> נטול מים, 500 גרם אבקת </td></tr><tr><td> DEPC שטופלו מים </td><td> Invitrogen </td><td> AM9922 </td><td> 1 ליטר </td></tr><tr><td> 10% SDS פתרון </td><td> Invitrogen </td><td> 24730-020 </td><td> Ultrapure, 1 ליטר </td></tr><tr><td> 0.5m EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> AM9262 </td><td> pH 8.0, 1 ליטר </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> SL2-25ML </td><td></td></tr><tr><td> 2ml סרולוגיות pippette </td><td> VWR </td><td> 89130-884 </td><td> פוליסטירן, סטרילי </td></tr><tr><td> BD פלקון Tubes צנטריפוגה </td><td> VWR </td><td> 21008-936 </td><td> 15 מ&quot;ל, סטרילי </td></tr><tr><td> פנול: כלורופורם: אלכוהול Isoamyl (25:24:1 v / v / v) </td><td> Invitrogen </td><td> 15593-031 </td><td> Ultrapure, 100 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-4 צנטריפוגלי התקן </td><td> Millipore </td><td> UFC803024 </td><td> Ultracel-30 קרום </td></tr><tr><td> 20X TE חוצץ, Rnase חינם </td><td> Invitrogen </td><td> T11493 </td><td> 100 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> Glycoblue </td><td> Invitrogen </td><td> AM9516 </td><td> 15mg/ml </td></tr></tbody></table>

separation of single-stranded dna, double-stranded dna and rna from an environmental viral community using hydroxyapatite chromatography

וירוסים, במיוחד bacteriophages (phages), הם גורמים ביולוגיים רבים ביותר על כדור הארץ 1,2. וירוסים לווסת את התא המארח השפע והמגוון, לתרום אופניים של חומרים מזינים, לשנות את פנוטיפ התא המארח, וכן להשפיע על האבולוציה של התא המארח הן וקהילות ויראלי באמצעות העברה רוחבית של גנים 3. מחקרים רבים הדגישו את המגוון הגנטי העצום של וירוסים הפוטנציאל הפונקציונלי שלהם במגוון רחב של סביבות טבעיות. טכניקות Metagenomic שימשו ללמוד את המגוון הטקסונומי ואת הפוטנציאל התפקודי של מכלולים מורכבים ויראלי שחבריה כוללים גדילי דנ&quot;א יחיד (ssDNA), פעמיים תקועים DNA (dsDNA) ו-RNA גנוטיפים 4-9. נוכחי בנייה ספריה פרוטוקולים המשמשים במחקר ה-DNA או RNA המכיל סביבתיים המכילים וירוסים דורשים טיפול ראשוני nuclease כדי להסיר תבניות nontargeted 10. עם זאת, הבנה מקיפה של משלימים את הגן הקולקטיבי של הקהילה וירוס והגיוון וירוס דורשת ידע של כל החברים ללא קשר להרכב הגנום. חלוקה של מטוהרים תת חומצות גרעין מספקת מנגנון יעיל שבאמצעותו ללמוד מכלולים ויראלי מבלי להקריב קבוצת משנה של החתימה הגנטית של הקהילה. Hydroxyapatite, צורה גבישית של סידן פוספט, כבר מועסקים הפרדה של חומצות גרעין, כמו גם חלבונים חיידקים, מאז 1960 11. על ידי ניצול האינטראקציה בין תשלום Ca חיובי טעון 2 + יונים של hydroxyapatite ואת עמוד השדרה פוספטים טעונים שלילית של תת חומצות גרעין, אפשר מעדיפים elute כל תת חומצות גרעין עצמאי של האחרים. העסקנו לאחרונה באסטרטגיה זו כדי fractionate באופן עצמאי את הגנום של ssDNA, dsDNA ו-RNA המכילים וירוסים בהכנה של רצפי DNA 12. כאן, אנו מציגים שיטה חלוקה ועל התאוששות של חומצות ssDNA, dsDNA ו-RNA גרעין ויראלית של מכלולים ויראלי באמצעות מעורבות chromotography hydroxyapatite.

Watch this Scientific Journal Video about Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography at JoVE.com

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

אנו מתארים שיטה יעילה כדי להפריד בין גדילי דנ&quot;א יחיד, כפול גדילי הדנ&quot;א ואת מולקולות רנ&quot;א נגיפי מקהילות הסביבה. חומצות גרעין הם מופרדים באמצעות כרומטוגרפיה hydroxyapatite עם ריכוז גדל והולך של פוספט המכיל הפגושים. שיטה זו מאפשרת בידוד של כל סוגי חומצות גרעין של נגיפי דגימות סביבתיות.

ההפרדה של ה-DNA חד גדילי, פעמיים תקועים DNA ו-RNA מהקהילה ויראלי הסביבה באמצעות כרומטוגרפיה hydroxyapatite

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

הדור של וירוס שפעת רקומביננטי מ-DNA פלסמיד

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

בידוד של פידליטי גרסאות של וירוסים RNA ו אפיון תדירות המוטציה וירוס

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

פיתוח נייד מסוג ספציפי נגד HIV gp120 aptamers למסירה siRNA

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

ההכנה של ה-DNA ויראלי של Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

פשוט פרוטוקול Chelex למיצוי DNA מ<em&gt; אנופלס</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

הקמתה של<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת ללמוד את התנהגות תאית של<em&gt; קנדידה glabrata</em&gt; בהמקרופאגים THP-1 אדם

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

שימוש בכימיה לחץ כדי למדוד את ההשפעה של זיהום ויראלי בסינתזת RNA Host-Cell

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

ממוצע של ויראלי מעטפת גליקופרוטאין Spikes מאלקטרוני Cryotomography שחזור באמצעות Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

בידוד של ההסתננות Leukocytes מעור העכבר באמצעות אנזימתי לעכל והפרדת צבע

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

פיתוח של מערכת מסירת DNA החסכוני ידי &quot;Acufection&quot; ויישומו מחקר עור

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...