Name: separation of single-stranded dna, double-stranded dna and rna from an environmental viral community using hydroxyapatite chromatography
Uploaded: 2011-09-29T13:00:00
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इस शोध विज्ञान के कार्यालय (BER), अमेरिकी ऊर्जा विभाग, सहकारी समझौते नहीं द्वारा समर्थित किया गया था. De-FC02 - 02ER63453, राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन माइक्रोबियल जीनोम अनुक्रमण कार्यक्रम (पुरस्कार संख्या 0,626,826 और 0,731,916). हम अपनी तकनीकी विशेषज्ञता और सलाह और के एरिक Wommack के लिए पर्यावरण नमूना संग्रह के साथ उसकी सहायता के लिए जॉन ग्लास धन्यवाद.

1. समाधान की तैयारी Hydroxyapatite क्रोमैटोग्राफी प्रदर्शन से पहले, फॉस्फेट बफ़र्स और तैयार रहना चाहिए hydroxyapatite ठीक से हाइड्रेटेड किया जाना चाहिए. <ol><li> 1M फास्फेट समाधान, पीएच 6.8: एक 1L फ्लास्क में बाँझ, DEPC इला?...

<ol>
	<li>Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokaryotes:+The+Unseen+Majority.">Prokaryotes: The Unseen Majority.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 6578-65 (1998).</li><li>Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophages:+evolution+of+the+majority.">Bacteriophages: evolution of the majority.</a> Theor Popul Biol. 61, 471-471 (2002).</li><li>Weinbauer, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophages:+Evolution+of+the+Majority.">Bacteriophages: Evolution of the Majority.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 127-127 (2004).</li><li>Dinsdale, E. A., Edwards, R. A., Hall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Metabolic+Profiling+of+Nine+Biomes.">Functional Metabolic Profiling of Nine Biomes.</a> Nature. 455, 830-830 (2008).</li><li>McDaniel, L., Breitbart, M., Mobberley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+Analysis+of+Lysogeny+in+Tampa+Bay:+Implications+for+Prophage+Gene+Expression.">Metagenomic Analysis of Lysogeny in Tampa Bay: Implications for Prophage Gene Expression.</a> PLoS ONE. 3, e3263-e3263 (2008).</li><li>Williamson, S. J., Rusch, D. B., Yooseph, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sorcerer+II+Global+Ocean+Sampling+Expedition:+Metagenomic+Characterization+of+Viruses+within+Aquatic+Microbial+Samples.">The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: Metagenomic Characterization of Viruses within Aquatic Microbial Samples.</a> PLoS ONE. 3, e1456-e1456 (2008).</li><li>Lang, A. S., Rise, M. L., Culley, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Viruses+in+the+Sea.">RNA Viruses in the Sea.</a> FEMS Microbiol Rev. 33, 295-295 (2009).</li><li>Ng, T. F., Manire, C., Borrowman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+Novel+Single-Stranded+DNA+Virus+from+a+Sea+Turtle+Fibropapilloma+by+using+Viral+Metagenomics.">Discovery of a Novel Single-Stranded DNA Virus from a Sea Turtle Fibropapilloma by using Viral Metagenomics.</a> J. Virol. 83, 2500-2500 (2009).</li><li>Rosario, K., Duffy, S., Breitbart, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Circovirus-like+Genome+Architectures+Revealed+by+Environmental+Metagenomics.">Diverse Circovirus-like Genome Architectures Revealed by Environmental Metagenomics.</a> J Gen Virol. 90, 2418-2418 (2009).</li><li>Culley, A. I., Lang, A. S., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+Analysis+of+Coastal+RNA+Virus+Communities.">Metagenomic Analysis of Coastal RNA Virus Communities.</a> Science. 312, 1795-1795 (2006).</li><li>Bernardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromotography+of+Nucleic+Acids+on+Hydroxyapatite.">Chromotography of Nucleic Acids on Hydroxyapatite.</a> Nature. 209, 779-779 (1965).</li><li>Andrews-Pfannkoch, C., Fadrosh, D. W., Thorpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyapatite-Mediated+Separation+of+Double-Stranded+DNA,+Single-Stranded+DNA+and+RNA+Genomes+from+Natural+Viral+Assemblages.">Hydroxyapatite-Mediated Separation of Double-Stranded DNA, Single-Stranded DNA and RNA Genomes from Natural Viral Assemblages.</a> Applied and environmental microbiology. 76, 5039-5039 (2010).</li><li>Wommack, K. E., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virioplankton:+Viruses+in+Aquatic+Ecosystems.">Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 64, 69-69 (2000).</li></ol>

hydroxyapatite क्रोमैटोग्राफी यहाँ प्रस्तुत पद्धति मिश्रित वायरल assemblages, जब लक्ष्य समुदाय के कुल न्यूक्लिक एसिड संरचना का अध्ययन से न्यूक्लिक एसिड के fractionation के लिए एक अत्यधिक कुशल और मजबूत उपकरण है. आम तौर पर, ss...

<table border="1"><tbody><tr><th> सामग्री नाम </th><th> कंपनी </th><th> सूचीपत्र संख्या </th><th> सूचीपत्र संख्या </th></tr><tr><td> Econo - स्तंभ </td><td> जैव - रेड </td><td> 737-0717 </td><td> 0.7cm आईडी पैकेज / 2 </td></tr><tr><td> Hydroxyapatite </td><td> जैव - रेड </td><td> 130-0520 </td><td> डीएनए ग्रेड जैव जेल HTP जेल, 100g/td&gt; </tr><tr><td> सोडियम फास्फेट, एक भस्मक </td><td> VWR </td><td> VW1497-01 </td><td> Monohydrate, क्रिस्टल 500g </td></tr><tr><td> सोडियम फास्फेट, Dibasic </td><td> VWR </td><td> VW1496-01 </td><td> निर्जल, पाउडर 500g </td></tr><tr><td> DEPC - इलाज जल </td><td> Invitrogen </td><td> AM9922 </td><td> 1L </td></tr><tr><td> 10% एसडीएस समाधान </td><td> Invitrogen </td><td> 24730-020 </td><td> Ultrapure, 1L </td></tr><tr><td> 0.5m EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> AM9262 </td><td> पीएच 8.0, 1L </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> SL2-25ml </td><td></td></tr><tr><td> 2ml सीरम वैज्ञानिक pippette </td><td> VWR </td><td> 89130-884 </td><td> Polystyrene बाँझ, </td></tr><tr><td> बी.डी. फाल्कन अपकेंद्रित्र ट्यूबें </td><td> VWR </td><td> 21008-936 </td><td> 15ml बाँझ, </td></tr><tr><td> Phenol: क्लोरोफॉर्म: Isoamyl शराब (25:24:1 v v / v /) </td><td> Invitrogen </td><td> 15593-031 </td><td> Ultrapure, 100ml </td></tr><tr><td> Amicon अल्ट्रा-4 केन्द्रापसारक डिवाइस </td><td> Millipore </td><td> UFC803024 </td><td> Ultracel-30 झिल्ली </td></tr><tr><td> 20X ते बफर, RNase मुक्त </td><td> Invitrogen </td><td> T11493 </td><td> 100ml </td></tr><tr><td> Glycoblue </td><td> Invitrogen </td><td> AM9516 </td><td> 15mg/ml </td></tr></tbody></table>

separation of single-stranded dna, double-stranded dna and rna from an environmental viral community using hydroxyapatite chromatography

वायरस, विशेष रूप से bacteriophages (phages), पृथ्वी 1,2 पर सबसे अनेक जैविक संस्थाओं हैं. वायरस मेजबान कोशिका बहुतायत और विविधता मिलाना, पोषक तत्वों की साइकिल चालन के लिए योगदान, मेजबान सेल phenotype परिवर्तन, और दोनों मेजबान और 3 जीनों के पार्श्व हस्तांतरण के माध्यम से सेल वायरल समुदायों के विकास को प्रभावित. कई अध्ययनों से वायरस और उनके प्राकृतिक वातावरण की एक किस्म में कार्य क्षमता के चक्कर आनुवंशिक विविधता पर प्रकाश डाला है. Metagenomic तकनीक वर्गीकरण विविधता और जटिल वायरल assemblages जिसका सदस्यों एकल असहाय डीएनए (ssDNA), डबल असहाय डीएनए (dsDNA) और आरएनए 4-9 जीनोटाइप होते कार्यात्मक क्षमता का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. वर्तमान पुस्तकालय निर्माण पर्यावरण के डीएनए युक्त या शाही सेना युक्त वायरस का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल एक प्रारंभिक nuclease उपचार की आवश्यकता होती है क्रम में nontargeted टेम्पलेट्स 10 हटायें है. हालांकि, वायरस समुदाय और वायरस विविधता के सामूहिक जीन पूरक की एक व्यापक समझ के जीनोम संरचना की परवाह किए बिना सभी सदस्यों के ज्ञान की आवश्यकता है. न्यूक्लिक एसिड उपप्रकारों शुद्ध Fractionation एक प्रभावी तंत्र है जिसके द्वारा समुदाय के आनुवंशिक हस्ताक्षर के एक सबसेट का त्याग किए बिना वायरल assemblages अध्ययन करने के लिए प्रदान करता है. Hydroxyapatite, कैल्शियम फॉस्फेट के एक क्रिस्टलीय फार्म, nucleic एसिड की जुदाई के रूप में के रूप में अच्छी तरह प्रोटीन और रोगाणुओं में नियोजित किया गया है, 11 1960 के दशक के बाद से, . सकारात्मक आरोप लगाया Ca 2 के बीच आरोप बातचीत का शोषण करके + hydroxyapatite और नकारात्मक आरोप लगाया न्यूक्लिक एसिड subtypes के फॉस्फेट रीढ़ के आयनों, यह संभव है preferentially प्रत्येक न्यूक्लिक एसिड subtype है दूसरों की स्वतंत्र elute . हमने हाल ही में डीएनए अनुक्रमण 12 की तैयारी में स्वतंत्र fractionate ssDNA, dsDNA और आरएनए युक्त वायरस के जीनोम के लिए इस रणनीति कार्यरत है. यहाँ, हम fractionation और ssDNA dsDNA, और शाही सेना मिश्रित वायरल hydroxyapatite chromotography का उपयोग assemblages से वायरल न्यूक्लिक एसिड की वसूली के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं.

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Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography (Video) | JoVE

हम एक कुशल पर्यावरण वायरल समुदायों से एकल असहाय डीएनए डबल असहाय डीएनए और शाही सेना अणु अलग विधि का वर्णन. न्यूक्लिक एसिड फॉस्फेट युक्त बफ़र्स की बढ़ती सांद्रता के साथ hydroxyapatite क्रोमैटोग्राफी का उपयोग fractionated हैं. इस विधि सभी पर्यावरणीय नमूनों से वायरल न्यूक्लिक एसिड प्रकार के अलगाव परमिट.

एक पर्यावरण वायरल Hydroxyapatite क्रोमैटोग्राफी का प्रयोग समुदाय से एकल असहाय डीएनए डबल असहाय डीएनए और आरएनए के पृथक्करण

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