Name: separation of single-stranded dna, double-stranded dna and rna from an environmental viral community using hydroxyapatite chromatography
Uploaded: 2011-09-29T13:00:00
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Questa ricerca è stata sostenuta dall&#39;Ufficio della Scienza (BER), US Department of Energy, Cooperativa accordo no. De-FC02-02ER63453, la National Science Foundation microbica Programma Genome Sequencing (numeri premio 0626826 e 0731916). Ringraziamo Giovanni in vetro per la sua competenza tecnica e di consulenza e K. Eric Wommack per la sua assistenza con la raccolta dei campioni ambientali.

1. Preparazione di soluzioni Prima di eseguire la cromatografia idrossiapatite, tamponi fosfato deve essere preparato e l&#39;idrossiapatite devono essere adeguatamente idratati. <ol><li> Soluzione fosfato 1M, pH 6,8: In un pallone da 1 litro sciogliere 119.98g di fosfato monobasico di sodio in 1 litro di sterile, DEPC trattati con H 2 O. Preparare una soluzione 1M fosfato di sodio bibasico in un pallone da 1 litro, sciogliendo 141.96g di fosfato bibasico di sodio in 1 litro di ...

<ol>
	<li>Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokaryotes:+The+Unseen+Majority.">Prokaryotes: The Unseen Majority.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 6578-65 (1998).</li><li>Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophages:+evolution+of+the+majority.">Bacteriophages: evolution of the majority.</a> Theor Popul Biol. 61, 471-471 (2002).</li><li>Weinbauer, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophages:+Evolution+of+the+Majority.">Bacteriophages: Evolution of the Majority.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 127-127 (2004).</li><li>Dinsdale, E. A., Edwards, R. A., Hall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Metabolic+Profiling+of+Nine+Biomes.">Functional Metabolic Profiling of Nine Biomes.</a> Nature. 455, 830-830 (2008).</li><li>McDaniel, L., Breitbart, M., Mobberley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+Analysis+of+Lysogeny+in+Tampa+Bay:+Implications+for+Prophage+Gene+Expression.">Metagenomic Analysis of Lysogeny in Tampa Bay: Implications for Prophage Gene Expression.</a> PLoS ONE. 3, e3263-e3263 (2008).</li><li>Williamson, S. J., Rusch, D. B., Yooseph, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sorcerer+II+Global+Ocean+Sampling+Expedition:+Metagenomic+Characterization+of+Viruses+within+Aquatic+Microbial+Samples.">The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: Metagenomic Characterization of Viruses within Aquatic Microbial Samples.</a> PLoS ONE. 3, e1456-e1456 (2008).</li><li>Lang, A. S., Rise, M. L., Culley, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Viruses+in+the+Sea.">RNA Viruses in the Sea.</a> FEMS Microbiol Rev. 33, 295-295 (2009).</li><li>Ng, T. F., Manire, C., Borrowman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+Novel+Single-Stranded+DNA+Virus+from+a+Sea+Turtle+Fibropapilloma+by+using+Viral+Metagenomics.">Discovery of a Novel Single-Stranded DNA Virus from a Sea Turtle Fibropapilloma by using Viral Metagenomics.</a> J. Virol. 83, 2500-2500 (2009).</li><li>Rosario, K., Duffy, S., Breitbart, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Circovirus-like+Genome+Architectures+Revealed+by+Environmental+Metagenomics.">Diverse Circovirus-like Genome Architectures Revealed by Environmental Metagenomics.</a> J Gen Virol. 90, 2418-2418 (2009).</li><li>Culley, A. I., Lang, A. S., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+Analysis+of+Coastal+RNA+Virus+Communities.">Metagenomic Analysis of Coastal RNA Virus Communities.</a> Science. 312, 1795-1795 (2006).</li><li>Bernardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromotography+of+Nucleic+Acids+on+Hydroxyapatite.">Chromotography of Nucleic Acids on Hydroxyapatite.</a> Nature. 209, 779-779 (1965).</li><li>Andrews-Pfannkoch, C., Fadrosh, D. W., Thorpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyapatite-Mediated+Separation+of+Double-Stranded+DNA,+Single-Stranded+DNA+and+RNA+Genomes+from+Natural+Viral+Assemblages.">Hydroxyapatite-Mediated Separation of Double-Stranded DNA, Single-Stranded DNA and RNA Genomes from Natural Viral Assemblages.</a> Applied and environmental microbiology. 76, 5039-5039 (2010).</li><li>Wommack, K. E., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virioplankton:+Viruses+in+Aquatic+Ecosystems.">Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 64, 69-69 (2000).</li></ol>

La metodologia cromatografia idrossiapatite qui presentato è uno strumento altamente efficiente e robusto per il frazionamento degli acidi nucleici da assemblaggi misti virale, quando l&#39;obiettivo è quello di studiare la composizione totale di acidi nucleici della comunità. In generale, ssDNA, RNA e DNA a doppia elica si eluire dalla colonna pho concentrazioni di tampone fosfato maggiore di circa 0.40m 0e ~ rispettivamente. Tuttavia, ogni preparazione di idrossiapatite può avere una composizione leggerme...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del materiale </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> Econo-Colonna </td><td> Bio-Rad </td><td> 737-0717 </td><td> 0,7 centimetri pacchetto ID / 2 </td></tr><tr><td> Idrossiapatite </td><td> Bio-Rad </td><td> 130-0520 </td><td> DNA Grado Bio-Gel Gel HTP, 100g/td&gt; </tr><tr><td> Fosfato di sodio, monobasico </td><td> VWR </td><td> VW1497-01 </td><td> Monoidrato, Crystal 500g </td></tr><tr><td> Fosfato di sodio, bibasico </td><td> VWR </td><td> VW1496-01 </td><td> Anidro, Polvere 500g </td></tr><tr><td> DEPC trattati con acqua </td><td> Invitrogen </td><td> AM9922 </td><td> 1L </td></tr><tr><td> 10% SDS Soluzione </td><td> Invitrogen </td><td> 24730-020 </td><td> Ultrapura, 1L </td></tr><tr><td> 0.5M EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> AM9262 </td><td> pH 8,0, 1L </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> SL2-25ML </td><td></td></tr><tr><td> 2ml sierologici pippette </td><td> VWR </td><td> 89130-884 </td><td> Polistirene, sterili </td></tr><tr><td> BD Falcon Centrifuga Tubi </td><td> VWR </td><td> 21008-936 </td><td> 15 ml, sterili </td></tr><tr><td> Fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (25:24:1 v / v / v) </td><td> Invitrogen </td><td> 15593-031 </td><td> Ultrapura, 100ml </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-4 dispositivo centrifugo </td><td> Millipore </td><td> UFC803024 </td><td> Ultracel-30 membrana </td></tr><tr><td> TE buffer 20X, RNasi libero </td><td> Invitrogen </td><td> T11493 </td><td> 100ml </td></tr><tr><td> Glycoblue </td><td> Invitrogen </td><td> AM9516 </td><td> 15mg/ml </td></tr></tbody></table>

separation of single-stranded dna, double-stranded dna and rna from an environmental viral community using hydroxyapatite chromatography

I virus, in particolare batteriofagi (fagi), sono le entità più numerosi biologica sulla Terra 1,2. I virus modulare cellula ospite abbondanza e la diversità, contribuiscono alla cicli dei nutrienti, alterare ospitare fenotipo delle cellule, e influenza l&#39;evoluzione di entrambi cellula ospite e le comunità virale attraverso il trasferimento laterale dei geni 3. Numerosi studi hanno messo in evidenza la diversità sconcertante genetica dei virus e delle loro potenzialità funzionali in una varietà di ambienti naturali. Tecniche di metagenomica sono state utilizzate per studiare la diversità tassonomica e le potenzialità funzionali di complessi assemblaggi virale i cui componenti contengono DNA a singolo filamento (ssDNA), DNA a doppia elica (dsDNA) e RNA genotipi 4-9. Attuali protocolli di costruzione della libreria usata per studiare l&#39;ambiente del DNA-RNA contenenti o contenenti virus richiedono un trattamento iniziale nucleasi al fine di rimuovere i modelli nontargeted 10. Tuttavia, una comprensione globale del complemento gene collettiva della comunità virus e la diversità del virus richiede la conoscenza di tutti i membri indipendentemente dalla composizione del genoma. Frazionamento di acido nucleico purificato sottotipi fornisce un meccanismo efficace per lo studio assemblaggi virale senza sacrificare un sottoinsieme della firma genetica della comunità. Idrossiapatite, una forma cristallina di fosfato di calcio, è stato impiegato nella separazione degli acidi nucleici, così come le proteine ​​e microbi, dal 1960 11. Sfruttando l&#39;interazione tra la carica a carica positiva Ca 2 + ioni di idrossiapatite e la spina dorsale fosfato con carica negativa dei sottotipi acidi nucleici, è possibile eluire preferenzialmente ogni sottotipo di acido nucleico indipendente dagli altri. Recentemente abbiamo utilizzato questa strategia per frazionare in maniera indipendente i genomi di ssDNA, dsDNA e RNA contenenti virus, in preparazione di sequenziamento del DNA 12. Qui, vi presentiamo un metodo per il frazionamento ed il recupero di ssDNA, dsDNA e RNA virale acidi nucleici da assemblaggi misti virale mediante cromatografia in idrossiapatite.

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Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography (Video) | JoVE

Descriviamo un metodo efficace per separare singolo filamento di DNA a doppio filamento di DNA e le molecole di RNA virale ambientale comunità. Gli acidi nucleici sono frazionate mediante cromatografia di idrossiapatite con concentrazioni crescenti di fosfati contenenti buffer. Questo metodo consente l&#39;isolamento di tutti i tipi virali acidi nucleici da campioni ambientali.

Separazione di DNA a singolo filamento, doppia elica del DNA e RNA da una Comunità Ambientale virale usando la cromatografia idrossiapatite

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