Name: separation of single-stranded dna, double-stranded dna and rna from an environmental viral community using hydroxyapatite chromatography
Uploaded: 2011-09-29T13:00:00
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Esta pesquisa foi suportada pelo Escritório de Ciência (BER), Departamento de Energia dos EUA, Acordo de Cooperação n º. De-FC02-02ER63453, o Programa Nacional Science Foundation Seqüenciamento do Genoma Microbiana (números 0626826 e 0731916 prêmio). Agradecemos a John de vidro para sua perícia técnica e aconselhamento e Eric K. Wommack por sua ajuda com a coleta de amostras ambientais.

1. Preparação de soluções Antes de realizar a cromatografia de hidroxiapatita, fosfato de buffers deve ser preparado e da hidroxiapatita deve ser adequadamente hidratado. <ol><li> Solução fosfato 1M, pH 6.8: Em um frasco 1L dissolver 119.98g de fosfato de sódio monobásico em 1L de estéril, DEPC tratados com H 2 O. Prepare uma solução de fosfato de sódio 1M dibásico em um frasco 1L, dissolvendo 141.96g de fosfato de sódio dibásico em 1L de estéril, DEPC tratados c...

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	<li>Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokaryotes:+The+Unseen+Majority.">Prokaryotes: The Unseen Majority.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 6578-65 (1998).</li><li>Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophages:+evolution+of+the+majority.">Bacteriophages: evolution of the majority.</a> Theor Popul Biol. 61, 471-471 (2002).</li><li>Weinbauer, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophages:+Evolution+of+the+Majority.">Bacteriophages: Evolution of the Majority.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 127-127 (2004).</li><li>Dinsdale, E. A., Edwards, R. A., Hall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Metabolic+Profiling+of+Nine+Biomes.">Functional Metabolic Profiling of Nine Biomes.</a> Nature. 455, 830-830 (2008).</li><li>McDaniel, L., Breitbart, M., Mobberley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+Analysis+of+Lysogeny+in+Tampa+Bay:+Implications+for+Prophage+Gene+Expression.">Metagenomic Analysis of Lysogeny in Tampa Bay: Implications for Prophage Gene Expression.</a> PLoS ONE. 3, e3263-e3263 (2008).</li><li>Williamson, S. J., Rusch, D. B., Yooseph, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sorcerer+II+Global+Ocean+Sampling+Expedition:+Metagenomic+Characterization+of+Viruses+within+Aquatic+Microbial+Samples.">The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: Metagenomic Characterization of Viruses within Aquatic Microbial Samples.</a> PLoS ONE. 3, e1456-e1456 (2008).</li><li>Lang, A. S., Rise, M. L., Culley, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Viruses+in+the+Sea.">RNA Viruses in the Sea.</a> FEMS Microbiol Rev. 33, 295-295 (2009).</li><li>Ng, T. F., Manire, C., Borrowman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+Novel+Single-Stranded+DNA+Virus+from+a+Sea+Turtle+Fibropapilloma+by+using+Viral+Metagenomics.">Discovery of a Novel Single-Stranded DNA Virus from a Sea Turtle Fibropapilloma by using Viral Metagenomics.</a> J. Virol. 83, 2500-2500 (2009).</li><li>Rosario, K., Duffy, S., Breitbart, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Circovirus-like+Genome+Architectures+Revealed+by+Environmental+Metagenomics.">Diverse Circovirus-like Genome Architectures Revealed by Environmental Metagenomics.</a> J Gen Virol. 90, 2418-2418 (2009).</li><li>Culley, A. I., Lang, A. S., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+Analysis+of+Coastal+RNA+Virus+Communities.">Metagenomic Analysis of Coastal RNA Virus Communities.</a> Science. 312, 1795-1795 (2006).</li><li>Bernardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromotography+of+Nucleic+Acids+on+Hydroxyapatite.">Chromotography of Nucleic Acids on Hydroxyapatite.</a> Nature. 209, 779-779 (1965).</li><li>Andrews-Pfannkoch, C., Fadrosh, D. W., Thorpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyapatite-Mediated+Separation+of+Double-Stranded+DNA,+Single-Stranded+DNA+and+RNA+Genomes+from+Natural+Viral+Assemblages.">Hydroxyapatite-Mediated Separation of Double-Stranded DNA, Single-Stranded DNA and RNA Genomes from Natural Viral Assemblages.</a> Applied and environmental microbiology. 76, 5039-5039 (2010).</li><li>Wommack, K. E., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virioplankton:+Viruses+in+Aquatic+Ecosystems.">Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 64, 69-69 (2000).</li></ol>

A metodologia de cromatografia de hidroxiapatita apresentado aqui é uma ferramenta altamente eficiente e robusto para o fracionamento de ácidos nucléicos a partir de conjuntos mistos viral, quando o objetivo é estudar a composição de ácidos nucléicos totais da comunidade. Geralmente, ssDNA, RNA e dsDNA vai saem da coluna pho concentrações de fosfato tampão maior que cerca de 0,40 m ~ 0and respectivamente. No entanto, cada preparação de hidroxiapatita pode ter uma composição ligeiramente diferente...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do material </th><th> Companhia </th><th> Número Catálogo </th><th> Número Catálogo </th></tr><tr><td> Coluna Econo- </td><td> Bio-Rad </td><td> 737-0717 </td><td> 0,7 centímetros pacote de ID / 2 </td></tr><tr><td> Hidroxiapatita </td><td> Bio-Rad </td><td> 130-0520 </td><td> DNA Grade Bio-Gel Gel HTP, 100g/td&gt; </tr><tr><td> Fosfato de sódio monobásico </td><td> VWR </td><td> VW1497-01 </td><td> Monohidratada, Crystal 500g </td></tr><tr><td> Fosfato de sódio dibásico </td><td> VWR </td><td> VW1496-01 </td><td> Anidro, em pó 500g </td></tr><tr><td> DEPC tratados com água </td><td> Invitrogen </td><td> AM9922 </td><td> 1L </td></tr><tr><td> 10% da solução SDS </td><td> Invitrogen </td><td> 24730-020 </td><td> UltraPure, 1L </td></tr><tr><td> EDTA 0.5M </td><td> Invitrogen </td><td> AM9262 </td><td> pH 8,0, 1L </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> SL2-25ML </td><td></td></tr><tr><td> 2ml sorológicos pippette </td><td> VWR </td><td> 89130-884 </td><td> Poliestireno, estéril </td></tr><tr><td> Centrífuga BD Tubos Falcon </td><td> VWR </td><td> 21008-936 </td><td> 15ml, estéril </td></tr><tr><td> Fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25:24:1 v / v / v) </td><td> Invitrogen </td><td> 15593-031 </td><td> UltraPure, 100ml </td></tr><tr><td> Amicon Dispositivo Ultra-4 Centrífuga </td><td> Millipore </td><td> UFC803024 </td><td> Ultracel-30 membrana </td></tr><tr><td> 20X TE Buffer, Rnase livre </td><td> Invitrogen </td><td> T11493 </td><td> 100ml </td></tr><tr><td> Glycoblue </td><td> Invitrogen </td><td> AM9516 </td><td> 15mg/ml </td></tr></tbody></table>

separation of single-stranded dna, double-stranded dna and rna from an environmental viral community using hydroxyapatite chromatography

Vírus, especialmente os bacteriófagos (fagos), são as entidades mais numerosas biológica em 1,2 Terra. Vírus da célula hospedeira modular a abundância e diversidade, contribuem para a ciclagem de nutrientes, alterar anfitrião fenótipo celular, e influenciar a evolução de ambas as células do hospedeiro e as comunidades viral através da transferência lateral de genes 3. Numerosos estudos têm destacado a diversidade genética impressionante de vírus e seu potencial funcional em uma variedade de ambientes naturais. Metagenomic técnicas têm sido usadas para estudar a diversidade taxonômica e potencial funcional do complexo assemblages viral cujos membros contêm DNA de fita simples (ssDNA), double-stranded DNA (dsDNA) e genótipos RNA 4-9. Protocolos biblioteca atual de construção usado para estudo de DNA contendo ambientais ou RNA contendo vírus requerem um tratamento nuclease inicial, a fim de remover os modelos não-alvo 10. No entanto, uma compreensão abrangente do complemento gene coletiva da comunidade vírus e diversidade de vírus requer o conhecimento de todos os membros, independentemente da composição do genoma. Fracionamento de ácido nucléico purificadas subtipos fornece um mecanismo eficaz pelo qual o estudo assemblages viral sem sacrificar um subconjunto de assinatura genética da comunidade. Hidroxiapatita, uma forma cristalina de fosfato de cálcio, tem sido empregada na separação de ácidos nucléicos, bem como proteínas e micróbios, desde os anos 1960 11. Ao explorar a interação entre o Ca carga com carga positiva 2 + íons da hidroxiapatita e da espinha dorsal de fosfato carregados negativamente dos subtipos de ácido nucléico, é possível eluir preferencialmente cada subtipo de ácido nucléico independente dos outros. Recentemente, esta estratégia empregada de forma independente fracionar os genomas de ssDNA, dsDNA e RNA-vírus que contenham em preparação de seqüenciamento de DNA 12. Aqui, apresentamos um método para o fracionamento e recuperação de ácidos viral ssDNA, dsDNA e RNA nucleico de misturado assemblages viral utilizando cromatografia de hidroxiapatita.

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Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Nós descrevemos um método eficiente para separar single-stranded DNA, dupla fita de DNA e RNA de moléculas ambientais comunidades viral. Os ácidos nucleicos são fracionados por cromatografia em fase de hidroxiapatita com concentrações crescentes de fosfato contendo buffers. Este método permite o isolamento de todos os tipos de ácido nucléico viral a partir de amostras ambientais.

Separação de Single-stranded DNA, Double-stranded DNA e RNA de uma Comunidade Ambiental Viral Usando Cromatografia hidroxiapatita

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Research

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