Name: separation of single-stranded dna, double-stranded dna and rna from an environmental viral community using hydroxyapatite chromatography
Uploaded: 2011-09-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography at JoVE.com

Работа выполнена при поддержке Управления науки (BER), Министерство энергетики США, соглашение о сотрудничестве нет. Де-FC02-02ER63453, микробного генома Национального научного фонда Секвенирование Program (награда номерами 0626826 и 0731916). Мы благодарим Джона стекло за его техническую экспертизу и консультации и К. Эрик Wommack за его помощь в экологической лаборатории.

1. Подготовка решений Перед выполнением гидроксиапатита хроматографии, фосфатные буферы должны быть подготовлены и гидроксиапатита должны быть надлежащим образом обезвоживания. <ol><li> 1М раствор фосфат, рН 6,8: в 1 л колбе растворяют 119.98g натрия фосфат однозамещенный в 1 л ...

<ol>
	<li>Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokaryotes:+The+Unseen+Majority.">Prokaryotes: The Unseen Majority.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 6578-65 (1998).</li><li>Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophages:+evolution+of+the+majority.">Bacteriophages: evolution of the majority.</a> Theor Popul Biol. 61, 471-471 (2002).</li><li>Weinbauer, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophages:+Evolution+of+the+Majority.">Bacteriophages: Evolution of the Majority.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 127-127 (2004).</li><li>Dinsdale, E. A., Edwards, R. A., Hall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Metabolic+Profiling+of+Nine+Biomes.">Functional Metabolic Profiling of Nine Biomes.</a> Nature. 455, 830-830 (2008).</li><li>McDaniel, L., Breitbart, M., Mobberley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+Analysis+of+Lysogeny+in+Tampa+Bay:+Implications+for+Prophage+Gene+Expression.">Metagenomic Analysis of Lysogeny in Tampa Bay: Implications for Prophage Gene Expression.</a> PLoS ONE. 3, e3263-e3263 (2008).</li><li>Williamson, S. J., Rusch, D. B., Yooseph, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sorcerer+II+Global+Ocean+Sampling+Expedition:+Metagenomic+Characterization+of+Viruses+within+Aquatic+Microbial+Samples.">The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: Metagenomic Characterization of Viruses within Aquatic Microbial Samples.</a> PLoS ONE. 3, e1456-e1456 (2008).</li><li>Lang, A. S., Rise, M. L., Culley, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Viruses+in+the+Sea.">RNA Viruses in the Sea.</a> FEMS Microbiol Rev. 33, 295-295 (2009).</li><li>Ng, T. F., Manire, C., Borrowman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+Novel+Single-Stranded+DNA+Virus+from+a+Sea+Turtle+Fibropapilloma+by+using+Viral+Metagenomics.">Discovery of a Novel Single-Stranded DNA Virus from a Sea Turtle Fibropapilloma by using Viral Metagenomics.</a> J. Virol. 83, 2500-2500 (2009).</li><li>Rosario, K., Duffy, S., Breitbart, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Circovirus-like+Genome+Architectures+Revealed+by+Environmental+Metagenomics.">Diverse Circovirus-like Genome Architectures Revealed by Environmental Metagenomics.</a> J Gen Virol. 90, 2418-2418 (2009).</li><li>Culley, A. I., Lang, A. S., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+Analysis+of+Coastal+RNA+Virus+Communities.">Metagenomic Analysis of Coastal RNA Virus Communities.</a> Science. 312, 1795-1795 (2006).</li><li>Bernardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromotography+of+Nucleic+Acids+on+Hydroxyapatite.">Chromotography of Nucleic Acids on Hydroxyapatite.</a> Nature. 209, 779-779 (1965).</li><li>Andrews-Pfannkoch, C., Fadrosh, D. W., Thorpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyapatite-Mediated+Separation+of+Double-Stranded+DNA,+Single-Stranded+DNA+and+RNA+Genomes+from+Natural+Viral+Assemblages.">Hydroxyapatite-Mediated Separation of Double-Stranded DNA, Single-Stranded DNA and RNA Genomes from Natural Viral Assemblages.</a> Applied and environmental microbiology. 76, 5039-5039 (2010).</li><li>Wommack, K. E., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virioplankton:+Viruses+in+Aquatic+Ecosystems.">Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 64, 69-69 (2000).</li></ol>

Гидроксиапатита методологии хроматографии, представленная здесь, высокоэффективный и надежный инструмент для фракционирования нуклеиновых кислот из смешанных вирусных ассоциаций, когда целью является изучение общего состава нуклеиновых кислот сообщества. Как правило, оцДНК, ?...

<table border="1"><tbody><tr><th> Материал Имя </th><th> Компания </th><th> Номер по каталогу </th><th> Номер по каталогу </th></tr><tr><td> Econo-колонки </td><td> Bio-Rad </td><td> 737-0717 </td><td> 0,7 см идентификатор пакета / 2 </td></tr><tr><td> Гидроксиапатит </td><td> Bio-Rad </td><td> 130-0520 </td><td> ДНК-класса Био-гель Гель HTP, 100g/td&gt; </tr><tr><td> Фосфат натрия, Монокальцийфосфат </td><td> VWR </td><td> VW1497-01 </td><td> Моногидрат, Crystal 500 </td></tr><tr><td> Фосфат натрия, Диаммоний </td><td> VWR </td><td> VW1496-01 </td><td> Безводный, порошок 500г </td></tr><tr><td> DEPC обработанной воды </td><td> Invitrogen </td><td> AM9922 </td><td> 1L </td></tr><tr><td> 10% SDS решения </td><td> Invitrogen </td><td> 24730-020 </td><td> Сверхчистых, 1л </td></tr><tr><td> 0,5 М ЭДТА </td><td> Invitrogen </td><td> AM9262 </td><td> рН 8,0, 1л </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> SL2-25МЛ </td><td></td></tr><tr><td> 2 мл серологических pippette </td><td> VWR </td><td> 89130-884 </td><td> Полистирол, стерильная </td></tr><tr><td> BD Трубы Сокол Центрифуга </td><td> VWR </td><td> 21008-936 </td><td> 15 мл, стерильная </td></tr><tr><td> Фенол: хлороформ: изоамиловый спирт (25:24:1 о / о / о) </td><td> Invitrogen </td><td> 15593-031 </td><td> Сверхчистых, 100мл </td></tr><tr><td> Amicon Ультра-4 Центробежные устройства </td><td> Millipore </td><td> UFC803024 </td><td> Ultracel-30 мембраны </td></tr><tr><td> 20X TE буфера, РНКазы свободный </td><td> Invitrogen </td><td> T11493 </td><td> 100 мл </td></tr><tr><td> Glycoblue </td><td> Invitrogen </td><td> AM9516 </td><td> 15mg/ml </td></tr></tbody></table>

separation of single-stranded dna, double-stranded dna and rna from an environmental viral community using hydroxyapatite chromatography

Вирусы, в частности, бактериофаги (фаги), являются наиболее многочисленными биологических объектов на 1,2 Земле. Вирусы модулировать хост обилие клеток и разнообразия, способствовать круговорот питательных веществ, изменяет фенотип клетки-хозяина, и влиять на развитие как клетки-хозяина и вирусных сообществ через боковой перенос генов 3. Многочисленные исследования выявили ошеломляющие генетического разнообразия вирусов и их функциональных возможностей в различных природных средах. Метагеномных методы были использованы для изучения таксономического разнообразия и функциональный потенциал комплекса вирусных ассоциаций, члены которых содержат одноцепочечных ДНК (оцДНК), двухцепочечной ДНК (дц) и РНК генотипов 4-9. Текущее строительство библиотеки протоколов, используемых для изучения экологических ДНК-содержащие и РНК-содержащих вирусов требует первоначального лечения нуклеазы, чтобы удалить nontargeted шаблонов 10. Тем не менее, полное понимание коллективных дополнением гена вируса и сообщества вирус разнообразие требует знания всех членов независимо от генома композиции. Фракционирование очищенных нуклеиновых кислот подтипов обеспечивает эффективный механизм для изучения вирусных ассоциаций, не жертвуя подмножество генетической подписью сообщества. Гидроксиапатита, кристаллической форме кальция фосфата, был принят на работу в отделение нуклеиновых кислот, а также белков и микробов, с 1960 года 11. Эксплуатируя взаимодействия зарядов между положительно заряженными Са 2 + ионов гидроксиапатита и отрицательно заряженные фосфатные основой нуклеиновые кислоты подтипов, можно преимущественно элюировать каждой нуклеиновой кислоты подтипа независимо от других. Недавно мы заняты этой стратегии самостоятельно фракционирования геномов оцДНК, двухцепочечной ДНК и РНК-содержащих вирусов в подготовке секвенирования ДНК 12. Здесь мы представляем метод фракционирования и восстановления оцДНК, двухцепочечной ДНК и РНК вирусной нуклеиновой кислоты из смешанных вирусных ассоциаций использовании гидроксиапатита хроматографии.

Watch this Scientific Journal Video about Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography at JoVE.com

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Мы описываем эффективный метод для отдельных одноцепочечных ДНК двухцепочечной молекулы ДНК и РНК от экологической вирусных общин. Нуклеиновых кислот фракционированного использовании гидроксиапатита хроматографии с увеличением концентрации фосфата содержащих буферы. Этот метод позволяет изоляции всех типов вирусных нуклеиновых кислот из проб окружающей среды.

Разделение одноцепочечных ДНК двухцепочечной ДНК и РНК из экологического сообщества Вирусный Использование гидроксиапатита хроматографии

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Генерация рекомбинантного вируса гриппа от ДНК плазмиды

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Выделение вариантов Fidelity РНК-содержащих вирусов и характеристика вирусов Частота мутаций

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

Развитие сотового типа конкретных анти-ВИЧ gp120 аптамеры для доставки миРНК

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Подготовка вирусных ДНК из нуклеокапсидов

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Простой протокол Chelex для выделения ДНК из<em&gt; Anopheles</em&gt; SPP.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Создание<em&gt; В пробирке</em&gt; Система по изучению внутриклеточных Поведение<em&gt; Candida glabrata</em&gt; В человека ТНР-1 макрофагов

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Использование химии Нажмите для оценки влияния вирусной инфекции на клетки-хозяина синтеза РНК

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

Усреднение вирусного гликопротеина оболочки Шипы от Electron Cryotomography реконструкциями с помощью Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Выделение Лейкоциты проникают из кожи мыши, используя ферментативные дайджест и Gradient Разделение

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

Разработка системы доставки Экономичный ДНК по «Acufection» и его применение к исследованию кожи

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...