Name: separation of single-stranded dna, double-stranded dna and rna from an environmental viral community using hydroxyapatite chromatography
Uploaded: 2011-09-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography at JoVE.com

Denna forskning stöds av Office of Science (BER), US Department of Energy, samarbetsavtal nej. De-FC02-02ER63453, National Science Foundations Mikrobiell genomsekvenseringsprojekt programmet (tilldelning nummer 0.626.826 och 0.731.916). Vi tackar John Glas för sin tekniska expertis och rådgivning och K. Eric Wommack för hans hjälp med miljö-provtagning.

1. Beredning av lösningar Innan du utför hydroxyapatit kromatografi måste fosfat buffertar vara förberedd och hydroxyapatit måste vara ordentligt släckt. <ol><li> 1M Fosfat, pH 6,8: I en 1L flaska löses 119.98g av natrium monobasiskt i 1L sterila, DEPC behandlade H 2 O. Förbered en 1M Dinatriumvätefosfat lösning i en 1L flaska genom att lösa 141.96g av Dinatriumvätefosfat i 1L sterila, DEPC behandlade H 2 O. Kombinera mono-och di-lösningar i förhållande...

<ol>
	<li>Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokaryotes:+The+Unseen+Majority.">Prokaryotes: The Unseen Majority.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 6578-65 (1998).</li><li>Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophages:+evolution+of+the+majority.">Bacteriophages: evolution of the majority.</a> Theor Popul Biol. 61, 471-471 (2002).</li><li>Weinbauer, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophages:+Evolution+of+the+Majority.">Bacteriophages: Evolution of the Majority.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 127-127 (2004).</li><li>Dinsdale, E. A., Edwards, R. A., Hall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Metabolic+Profiling+of+Nine+Biomes.">Functional Metabolic Profiling of Nine Biomes.</a> Nature. 455, 830-830 (2008).</li><li>McDaniel, L., Breitbart, M., Mobberley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+Analysis+of+Lysogeny+in+Tampa+Bay:+Implications+for+Prophage+Gene+Expression.">Metagenomic Analysis of Lysogeny in Tampa Bay: Implications for Prophage Gene Expression.</a> PLoS ONE. 3, e3263-e3263 (2008).</li><li>Williamson, S. J., Rusch, D. B., Yooseph, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sorcerer+II+Global+Ocean+Sampling+Expedition:+Metagenomic+Characterization+of+Viruses+within+Aquatic+Microbial+Samples.">The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: Metagenomic Characterization of Viruses within Aquatic Microbial Samples.</a> PLoS ONE. 3, e1456-e1456 (2008).</li><li>Lang, A. S., Rise, M. L., Culley, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Viruses+in+the+Sea.">RNA Viruses in the Sea.</a> FEMS Microbiol Rev. 33, 295-295 (2009).</li><li>Ng, T. F., Manire, C., Borrowman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+Novel+Single-Stranded+DNA+Virus+from+a+Sea+Turtle+Fibropapilloma+by+using+Viral+Metagenomics.">Discovery of a Novel Single-Stranded DNA Virus from a Sea Turtle Fibropapilloma by using Viral Metagenomics.</a> J. Virol. 83, 2500-2500 (2009).</li><li>Rosario, K., Duffy, S., Breitbart, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Circovirus-like+Genome+Architectures+Revealed+by+Environmental+Metagenomics.">Diverse Circovirus-like Genome Architectures Revealed by Environmental Metagenomics.</a> J Gen Virol. 90, 2418-2418 (2009).</li><li>Culley, A. I., Lang, A. S., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+Analysis+of+Coastal+RNA+Virus+Communities.">Metagenomic Analysis of Coastal RNA Virus Communities.</a> Science. 312, 1795-1795 (2006).</li><li>Bernardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromotography+of+Nucleic+Acids+on+Hydroxyapatite.">Chromotography of Nucleic Acids on Hydroxyapatite.</a> Nature. 209, 779-779 (1965).</li><li>Andrews-Pfannkoch, C., Fadrosh, D. W., Thorpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyapatite-Mediated+Separation+of+Double-Stranded+DNA,+Single-Stranded+DNA+and+RNA+Genomes+from+Natural+Viral+Assemblages.">Hydroxyapatite-Mediated Separation of Double-Stranded DNA, Single-Stranded DNA and RNA Genomes from Natural Viral Assemblages.</a> Applied and environmental microbiology. 76, 5039-5039 (2010).</li><li>Wommack, K. E., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virioplankton:+Viruses+in+Aquatic+Ecosystems.">Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 64, 69-69 (2000).</li></ol>

Hydroxyfosfaten kromatografi metoden som presenteras här är ett mycket effektivt och robust verktyg för fraktionering av nukleinsyror från blandade virus assemblage, när målet är att studera den totala nukleinsyra sammansättningen av samhället. I allmänhet kommer ssDNA, RNA och dsDNA rinna genom kolonnen Pho fosfatbuffert högre koncentrationer än cirka ~ grundljusnivån från 0 0,40 m respektive. Däremot kan varje beredning av hydroxyapatit har en något annorlunda sammansättning och elueringstid ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Materialnamn </th><th> Företag </th><th> Katalognummer </th><th> Katalognummer </th></tr><tr><td> Econo-Kolumn </td><td> Bio-Rad </td><td> 737-0717 </td><td> 0.7cm ID-paket / 2 </td></tr><tr><td> Hydroxyapatit </td><td> Bio-Rad </td><td> 130-0520 </td><td> DNA Grade Bio-Gel HTP Gel, 100g/td&gt; </tr><tr><td> Natriumfosfat, enbasiskt </td><td> VWR </td><td> VW1497-01 </td><td> Monohydrat, Crystal 500g </td></tr><tr><td> Natriumfosfat, dibasiskt </td><td> VWR </td><td> VW1496-01 </td><td> Vattenfri, Powder 500g </td></tr><tr><td> DEPC-behandlat vatten </td><td> Invitrogen </td><td> AM9922 </td><td> 1L </td></tr><tr><td> 10% SDS-lösning </td><td> Invitrogen </td><td> 24730-020 </td><td> Ultrarent, 1L </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> AM9262 </td><td> pH 8,0, 1L </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> SL2-25ml </td><td></td></tr><tr><td> 2ml serologiska pippette </td><td> VWR </td><td> 89130-884 </td><td> Polystyren, Sterila </td></tr><tr><td> BD Falcon Centrifugrör </td><td> VWR </td><td> 21008-936 </td><td> 15ml, Sterila </td></tr><tr><td> Fenol: Kloroform: Isoamyl Alkohol (25:24:1 v / v / v) </td><td> Invitrogen </td><td> 15593-031 </td><td> Ultrarent, 100ml </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-4 Centrifugal enhet </td><td> Millipore </td><td> UFC803024 </td><td> Ultracel-30 membran </td></tr><tr><td> 20X TE buffert, RNas gratis </td><td> Invitrogen </td><td> T11493 </td><td> 100ml </td></tr><tr><td> Glycoblue </td><td> Invitrogen </td><td> AM9516 </td><td> 15mg/ml </td></tr></tbody></table>

separation of single-stranded dna, double-stranded dna and rna from an environmental viral community using hydroxyapatite chromatography

Virus, särskilt bakteriofager (fager), är de mest talrika biologiska enheter på jorden 1,2. Virus modulera överflöd värdcellen och mångfald, bidrar till omsättning av näringsämnen, förändra värdcellens fenotyp, och påverka utvecklingen av både värdcell och virus samhällen genom den laterala överföring av gener 3. Ett flertal studier har lyft fram häpnadsväckande genetiska mångfalden av virus och deras funktionella potential i en mängd olika naturliga miljöer. Metagenomic tekniker har använts för att studera den taxonomiska mångfald och funktionella potential av komplexa virus sammansättningar vars ledamöter innehålla enda DNA (ssDNA), dubbel-strängat DNA (dsDNA) och RNA-genotyper 4-9. Nuvarande bibliotek konstruktion protokoll som används för att studera miljö-DNA-innehållande eller RNA som innehåller virus kräver en initial nukleas behandling för att avlägsna nontargeted mallar 10. Kräver dock en omfattande förståelse av den kollektiva genen komplement av viruset gemenskapen och virus mångfald kunskap om alla medlemmar oberoende av genomet sammansättning. Fraktionering av renat nukleinsyra subtyper ger en effektiv mekanism för att studera virus assemblage utan att offra en del av samhällets genetiska signatur. Hydroxyapatit, en kristallin form av kalciumfosfat, har varit anställd vid separation av nukleinsyror, samt proteiner och mikrober, sedan 1960-talet 11. Genom att utnyttja den avgift samspelet mellan de positivt laddade Ca 2 + joner av hydroxyapatit och negativt laddade fosfat ryggraden av nukleinsyra subtyper, är det möjligt att företrädesvis eluera varje nukleinsyra subtyp oberoende av de andra. Vi arbetar nyligen denna strategi att självständigt fraktioneras av genomen hos ssDNA, dsDNA och RNA-innehållande virus i beredningen av DNA-sekvensering 12. Här presenterar vi en metod för fraktionering och återvinning av ssDNA, dsDNA och RNA-virus nukleinsyror från blandade virus assemblage med hydroxyapatit chromotography.

Watch this Scientific Journal Video about Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography at JoVE.com

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Vi beskriver en effektiv metod att separera enda DNA, dubbelsträngat DNA och RNA-molekyler från miljö-virus samhällen. Nukleinsyror är fraktionerade med hydroxyapatit kromatografi med ökande koncentrationer av fosfat som innehåller buffertar. Denna metod medger isolering av alla virus-nukleinsyra typer från miljöprover.

Separation av enda DNA, dubbel-strängat DNA och RNA ur miljösynpunkt Viral gemenskapen med hjälp av hydroxyapatit Kromatografi

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Generering av Rekombinant influensavirus från Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Isolering av Fidelity Varianter av RNA-virus och karakterisering av virus mutationsfrekvensen

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

Utveckling av celltyp specifika anti-HIV gp120 aptamers för siRNA leverans

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Beredning av viral DNA från Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

En enkel Chelex protokoll för DNA-extraktion från<em&gt; Anopheles</em&gt; SPP.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Inrättande av en<em&gt; In vitro</em&gt; System för att studera intracellulära Beteende<em&gt; Candida glabrata</em&gt; I Human THP-1 makrofager

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Använda klicka kemi för att mäta effekten av virusinfektion på Host-cell RNA-syntes

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

Medelvärdes av Viral höljesglykoproteinet Spikes från Electron Cryotomography rekonstruktioner använder Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Isolering av infiltrerande leukocyter från mus Skin Använda Enzymatisk Digest och Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

Utveckling av en ekonomisk DNA Delivery System av &quot;Acufection&quot; och dess tillämpning på Skin Research

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...