Name: separation of single-stranded dna, double-stranded dna and rna from an environmental viral community using hydroxyapatite chromatography
Uploaded: 2011-09-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography at JoVE.com

Bu araştırma, Bilim Ofisi (BER), ABD Enerji Bakanlığı, hayır Anlaşması Kooperatifi tarafından desteklenmiştir. De-FC02-02ER63453, Ulusal Bilim Vakfı Mikrobiyal Genomu Sıralama Programı (ödül numaraları 0.626.826 ve 0.731.916). Biz çevresel örnek toplama ile yaptığı yardım için teknik uzmanlık ve danışmanlık ve K. Eric Wommack John Cam teşekkür ederiz.

1. Çözeltilerin Hazırlanması Hidroksiapatit kromatografi gerçekleştirmeden önce, fosfat tamponlar hazırlıklı olmak gerekir ve hidroksiapatit düzgün sulu olmalıdır. <ol><li> 1M Fosfat Çözüm pH 6,8: 1L şişesi, steril, DEPC ile tedavi edilen H 2 O. 1L sodyum fosfat tekbazlı 119.98g çözülür Steril, DEPC ile tedavi edilen H 2 O. 1L sodyum fosfat dibazik 141.96g eriterek 1L balonuna 1M sodyum fosfat dibazik çözüm hazırlayın 1:1 oranında mono-ve...

<ol>
	<li>Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokaryotes:+The+Unseen+Majority.">Prokaryotes: The Unseen Majority.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 6578-65 (1998).</li><li>Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophages:+evolution+of+the+majority.">Bacteriophages: evolution of the majority.</a> Theor Popul Biol. 61, 471-471 (2002).</li><li>Weinbauer, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophages:+Evolution+of+the+Majority.">Bacteriophages: Evolution of the Majority.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 127-127 (2004).</li><li>Dinsdale, E. A., Edwards, R. A., Hall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Metabolic+Profiling+of+Nine+Biomes.">Functional Metabolic Profiling of Nine Biomes.</a> Nature. 455, 830-830 (2008).</li><li>McDaniel, L., Breitbart, M., Mobberley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+Analysis+of+Lysogeny+in+Tampa+Bay:+Implications+for+Prophage+Gene+Expression.">Metagenomic Analysis of Lysogeny in Tampa Bay: Implications for Prophage Gene Expression.</a> PLoS ONE. 3, e3263-e3263 (2008).</li><li>Williamson, S. J., Rusch, D. B., Yooseph, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sorcerer+II+Global+Ocean+Sampling+Expedition:+Metagenomic+Characterization+of+Viruses+within+Aquatic+Microbial+Samples.">The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: Metagenomic Characterization of Viruses within Aquatic Microbial Samples.</a> PLoS ONE. 3, e1456-e1456 (2008).</li><li>Lang, A. S., Rise, M. L., Culley, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Viruses+in+the+Sea.">RNA Viruses in the Sea.</a> FEMS Microbiol Rev. 33, 295-295 (2009).</li><li>Ng, T. F., Manire, C., Borrowman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+Novel+Single-Stranded+DNA+Virus+from+a+Sea+Turtle+Fibropapilloma+by+using+Viral+Metagenomics.">Discovery of a Novel Single-Stranded DNA Virus from a Sea Turtle Fibropapilloma by using Viral Metagenomics.</a> J. Virol. 83, 2500-2500 (2009).</li><li>Rosario, K., Duffy, S., Breitbart, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Circovirus-like+Genome+Architectures+Revealed+by+Environmental+Metagenomics.">Diverse Circovirus-like Genome Architectures Revealed by Environmental Metagenomics.</a> J Gen Virol. 90, 2418-2418 (2009).</li><li>Culley, A. I., Lang, A. S., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+Analysis+of+Coastal+RNA+Virus+Communities.">Metagenomic Analysis of Coastal RNA Virus Communities.</a> Science. 312, 1795-1795 (2006).</li><li>Bernardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromotography+of+Nucleic+Acids+on+Hydroxyapatite.">Chromotography of Nucleic Acids on Hydroxyapatite.</a> Nature. 209, 779-779 (1965).</li><li>Andrews-Pfannkoch, C., Fadrosh, D. W., Thorpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyapatite-Mediated+Separation+of+Double-Stranded+DNA,+Single-Stranded+DNA+and+RNA+Genomes+from+Natural+Viral+Assemblages.">Hydroxyapatite-Mediated Separation of Double-Stranded DNA, Single-Stranded DNA and RNA Genomes from Natural Viral Assemblages.</a> Applied and environmental microbiology. 76, 5039-5039 (2010).</li><li>Wommack, K. E., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virioplankton:+Viruses+in+Aquatic+Ecosystems.">Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 64, 69-69 (2000).</li></ol>

Burada sunulan hidroksiapatit kromatografi metodolojisinin amacı, toplumun toplam nükleik asit kompozisyonu okumak için karışık viral toplulukları, nükleik asitlerin fraksiyonasyon için son derece verimli ve güçlü bir araç. Genellikle, ssDNA, RNA ve dsDNA yaklaşık ~ 0and 0.40M sırasıyla daha fazla sütun pho fosfat tamponu konsantrasyonları Zehir. Ancak, bilinen nükleik asitler (örneğin ekili bir virüs hazırlık) kullanarak her bir hazırlık test etmek için önemli böylece hidroksiapat...

<table border="1"><tbody><tr><th> Malzeme Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog Numarası </th><th> Katalog Numarası </th></tr><tr><td> Econo-Kolon </td><td> Bio-Rad </td><td> 737-0717 </td><td> 0.7cm ID paket / 2 </td></tr><tr><td> Hidroksiapatit </td><td> Bio-Rad </td><td> 130-0520 </td><td> DNA Sınıf Bio-Gel HTP Jel, 100g/td&gt; </tr><tr><td> Sodyum Fosfat, mono </td><td> VWR </td><td> VW1497-01 </td><td> Monohidrat, Kristal 500g </td></tr><tr><td> Sodyum Fosfat, Dibazik </td><td> VWR </td><td> VW1496-01 </td><td> Susuz, Toz 500g </td></tr><tr><td> DEPC-tedavi Su </td><td> Invitrogen </td><td> AM9922 </td><td> 1L </td></tr><tr><td> % 10 SDS Çözüm </td><td> Invitrogen </td><td> 24730-020 </td><td> Ultrapure, 1l </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> AM9262 </td><td> pH 8.0, 1L </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> SL2-25ml </td><td></td></tr><tr><td> 2ml serolojik pippette </td><td> VWR </td><td> 89130-884 </td><td> Polistiren, Steril </td></tr><tr><td> BD Falcon Santrifüj Tüpleri </td><td> VWR </td><td> 21008-936 </td><td> 15ml, Steril </td></tr><tr><td> Fenol: Kloroform: izoamil Alkol (25:24:1 v / v / v) </td><td> Invitrogen </td><td> 15593-031 </td><td> Ultrapure, 100ml </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-4 Santrifüj Aygıt </td><td> Millipore </td><td> UFC803024 </td><td> Ultracel-30 membran </td></tr><tr><td> 20X TE Tampon, Rnase ücretsiz </td><td> Invitrogen </td><td> T11493 </td><td> 100ml </td></tr><tr><td> Glycoblue </td><td> Invitrogen </td><td> AM9516 </td><td> 15mg/ml </td></tr></tbody></table>

separation of single-stranded dna, double-stranded dna and rna from an environmental viral community using hydroxyapatite chromatography

Virüsler, özellikle bakteriyofajlar (faj), Dünya&#39;nın 1,2 en çok sayıda biyolojik varlıklar . Virüsler konak hücre bolluğu ve çeşitliliği, besin bisiklet modüle katkıda hücre fenotipi ev sahipliği değiştirebilir ve lateral transferi yoluyla genleri 3 konak hücre ve viral toplulukların evrim etkisi. Çeşitli çalışmalar, virüsler ve doğal ortamlarında çeşitli fonksiyonel potansiyeli şaşırtıcı genetik çeşitlilik sermiştir. Taksonomik çeşitlilik ve üyeleri, tek iplikli DNA (ssDNA), çift iplikli DNA (dsDNA) ve RNA genotipleri 4-9 içeren karmaşık viral toplulukları fonksiyonel bir potansiyel çalışma Metagenomic teknikleri kullanılmıştır. Şu kütüphane inşaatı çevre DNA içeren virüsler veya RNA içeren çalışmada kullanılan protokolleri nontargeted 10 şablonları kaldırmak için bir başlangıç ​​nukleaz tedavisi gerektirir. Ancak, kapsamlı bir anlayış, virüs topluluk ve virüs çeşitliliği kolektif gen kompleman genom kompozisyonu ne olursa olsun, tüm üyelerinin bilgi gerektirir. Nükleik asit alt tipleri saflaştırılmış Fraksiyonu, toplumun genetik imza bir alt kümesi ödün vermeden viral toplulukları incelemek için etkili bir mekanizma sağlar. Hidroksiapatit, kristal formu, kalsiyum fosfat, 1960&#39;larda 11 yılından bu yana, nükleik asitlerin ayrılması, protein ve mikropların yanı sıra istihdam edilmiştir . + Pozitif yüklü Ca 2 arasındaki ücret etkileşimini exploit hidroksiapatit ve nükleik asit alt tiplerinin negatif yüklü fosfat omurgası iyonlar, tercihen diğerlerinden bağımsız olarak her bir nükleik asit alt tipi Zehir mümkündür. Bu stratejinin istihdam Biz son zamanlarda, DNA dizi analizi 12 hazırlanması ssDNA, dsDNA ve RNA içeren virüsler bağımsız damıtmak genomların . Burada, hidroksiapatit kromatografileri kullanarak karışık viral toplulukları ssDNA, dsDNA ve RNA viral nükleik asitlerin fraksiyonasyon ve kurtarma için bir yöntem mevcut.

Watch this Scientific Journal Video about Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography at JoVE.com

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Biz çevre viral toplulukların tek iplikli DNA, çift iplikli DNA ve RNA molekülleri ayırmak için etkili bir yöntem açıklanmaktadır. Nükleik asitler, fosfat içeren tamponlar artan konsantrasyonları ile hidroksiapatit kromatografisi kullanılarak fraksiyone. Bu yöntem, tüm çevre örneklerinden viral nükleik asit türleri izolasyonu izin verir.

Tek iplikli DNA, çift iplikli DNA ve RNA Hidroksiapatit Kromatografisi kullanarak bir Çevre Viral Topluluk ayrılması

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Plazmid DNA Rekombinant Grip Virüsü Üretimi

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Virüs mutasyon Frekans RNA Virüsler ve Karakterizasyonu Fidelity Varyantlar izolasyonu

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

Hücre tipi siRNA teslimat için özel anti-HIV gp120 aptamers Geliştirme

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Nucleocapsids gelen Viral DNA hazırlanması

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

DNA ekstraksiyonu için A Simple Chelex Protokolü<em&gt; Anofel</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Ana-Hücre RNA sentezi üzerinde Viral Enfeksiyon Etkisi Tedbir tıklayın Kimya Kullanımı

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

Jsubtomo kullanılarak Elektron Cryotomography Rekonstrüksiyonunda ikinci viral zarf glikoproteini Spikes ortalamasını

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Enzimatik Digest ve Gradient Ayırma kullanma Fare Skin gelen sızan lökositlerin İzolasyonu

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

&quot;Acufection&quot; ve Cilt Araştırmaları onun Uygulaması tarafından bir Ekonomik DNA Yerleştirme Sisteminin Geliştirilmesi

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...