Name: a quantitative assay for insulin-expressing colony-forming progenitors
Uploaded: 2011-11-28T12:00:00
Duration: 14 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors at JoVE.com

De auteurs willen dr. Klaus Kaestner danken voor de gave van de muis Ngn3-EGFP embryonale stamcellen lijn, mevrouw Lucy Brown en de Analytische cytometrie Core voor hulp in cel sorteren. Dit werk werd deels gefinancierd door NIH beurzen R21DK069997 en R01DK081587 toegekend aan HTK en van Californië Instituut voor Regeneratieve Geneeskunde (CIRM) training subsidies toegekend aan MW en LS

<ol>
	<li>Ku, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Committing+embryonic+stem+cells+to+early+endocrine+pancreas+in+vitro.">Committing embryonic stem cells to early endocrine pancreas in vitro.</a> Stem cells. 22, 1205-1217 (2004).</li><li>Ku, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-expressing+colonies+developed+from+murine+embryonic+stem+cell-derived+progenitors.">Insulin-expressing colonies developed from murine embryonic stem cell-derived progenitors.</a> Diabetes. 56, 921-929 (2007).</li><li>Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+in+vitro+differentiation+assay+for+pancreatic-like+cell+development+from+murine+embryonic+stem+cells:+detailed+gene+expression+analysis.">Characterization of an in vitro differentiation assay for pancreatic-like cell development from murine embryonic stem cells: detailed gene expression analysis.</a> Assay. Drug. Dev. Technol. 9, 403-419 (2011).</li><li>Lee, C. S., Perreault, N., Brestelli, J. E., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenin+3+is+essential+for+the+proper+specification+of+gastric+enteroendocrine+cells+and+the+maintenance+of+gastric+epithelial+cell+identity.">Neurogenin 3 is essential for the proper specification of gastric enteroendocrine cells and the maintenance of gastric epithelial cell identity.</a> Genes. 16, 1488-1497 (2002).</li><li>Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+the+pancreatic+lineage:+NGN3++cells+are+islet+progenitors+and+are+distinct+from+duct+progenitors.">Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors.</a> Development. 129, 2447-2457 (2002).</li><li>Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+proliferation+of+hematopoietic+stem+cells.">Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells.</a> Blood. 81, 2844-2853 (1993).</li><li>Gittes, G. K., Galante, P. E., Hanahan, D., Rutter, W. J., Debase, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-specific+morphogenesis+in+the+developing+pancreas:+role+of+mesenchymal+factors.">Lineage-specific morphogenesis in the developing pancreas: role of mesenchymal factors.</a> Development. 122, 439-447 (1996).</li><li>Miralles, F., Battelino, T., Czernichow, P., Scharfmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+plays+a+key+role+in+morphogenesis+of+the+pancreatic+islets+of+Langerhans+by+controlling+the+activity+of+the+matrix+metalloproteinase+MMP-2.">TGF-beta plays a key role in morphogenesis of the pancreatic islets of Langerhans by controlling the activity of the matrix metalloproteinase MMP-2.</a> J. Cell. Biol. 143, 827-836 (1998).</li><li>Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cultivation+of+human+islets+from+expanded+ductal+tissue.">In vitro cultivation of human islets from expanded ductal tissue.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 7999-8004 (2000).</li><li>Gao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+endocrine+progenitor+cells+and+critical+factors+for+their+differentiation+in+human+adult+pancreatic+cell+culture.">Characterization of endocrine progenitor cells and critical factors for their differentiation in human adult pancreatic cell culture.</a> Diabetes. 52, 2007-2015 (2003).</li><li>Gao, R., Ustinov, J., Korsgren, O., Otonkoski, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+neogenesis+of+human+islets+reflects+the+plasticity+of+differentiated+human+pancreatic+cells.">In vitro neogenesis of human islets reflects the plasticity of differentiated human pancreatic cells.</a> Diabetologia. 48, 2296-2304 (2005).</li><li>Suarez-Pinzon, W. L., Lakey, J. R., Brand, S. J., Rabinovitch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy+with+epidermal+growth+factor+and+gastrin+induces+neogenesis+of+human+islet+beta-cells+from+pancreatic+duct+cells+and+an+increase+in+functional+beta-cell+mass.">Combination therapy with epidermal growth factor and gastrin induces neogenesis of human islet beta-cells from pancreatic duct cells and an increase in functional beta-cell mass.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 90, 3401-3409 (2005).</li><li>Hao, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-cell+differentiation+from+nonendocrine+epithelial+cells+of+the+adult+human+pancreas.">Beta-cell differentiation from nonendocrine epithelial cells of the adult human pancreas.</a> Nature Medicine. 12, 310-316 (2006).</li><li>Ku, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+pancreatic+progenitor+cells--recent+studies.">Minireview: pancreatic progenitor cells--recent studies.</a> Endocrinology. 149, 4312-4316 (2008).</li><li>Seaberg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+identification+of+multipotent+precursors+from+adult+mouse+pancreas+that+generate+neural+and+pancreatic+lineages.">Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages.</a> Nature Biotechnology. 22, 1115-1124 (2004).</li><li>Rovira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+centroacinar/terminal+ductal+progenitor+cells+in+adult+mouse+pancreas.">Isolation and characterization of centroacinar/terminal ductal progenitor cells in adult mouse pancreas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 75-80 (2010).</li></ol>

We hebben niets te onthullen.

Kolonie assays dat de kwantitatieve en functionele evaluatie van de individuele pancreas voorlopercellen staat zijn tot nu toe beperkt is, die sterk de voortgang in de onderzoeken van de alvleesklier stam en progenitor celbiologie belemmerd. De essentie van een kolonie test is dat het de intrinsieke vermogen van stamcellen, in plaats van alleen hun fenotype maatregelen, zodat de functionaliteit en mogelijkheden van de lijn progenitorcellen in acht te nemen. Het is ook een kwantitatief instrument dat het aantal voorouders kan bepalen in een bepaalde populatie. In de hematopoietische stamcellen veld, zijn kolonie assays belangrijke rol gespeeld bij de identificatie, evenals het ontcijferen van de groeifactor eisen, interacties en mechanismen die de lijn inzet van deze cellen. 6 Op het gebied van pancreas progenitor celbiologie, pancreas-orgel 7 , 8 of bulk culturen 9-13 zijn bedacht, maar zulke testen niet te pakken biologische Questions op het niveau van enkele cel. Zonder enkele cel-analyses, kan het bestaan ​​van multi-potentieel alvleesklier stam / voorlopercellen niet eenduidig ​​bewezen worden. 14 Hier laten we zien dat insuline-expressie kolonievormende voorouders kan worden getest met behulp van een drie-dimensionale, Matrigel-bevattende, semi-vaste cultuur-systeem. Hoewel een schorsing kweeksysteem 15,16 is ontwikkeld die het mogelijk maakt alleenstaande volwassene de pancreas voorlopercellen te laten groeien en differentiëren in &quot;pancreatospheres&quot;, onze kolonie test biedt extra voordelen. De eerste, onze semi-vaste voedingsbodems systeem maakt het mogelijk plating van maximaal 25.000 gesorteerde cellen per 500 microliter cultuur media per 24-well met behoud van de daaruit voortvloeiende kolonie vorming in het lineaire bereik. 2 In tegenstelling tot de ophanging pancreatosphere test het gebruik van enkele vereist cel depositie methode van de cel sorter om enkele cel-analyses mogelijk te maken, en dus een groter volume van cultuur en media incubator ruimtezijn vereist. Daarom is onze kolonie test is relatief eenvoudig en kosteneffectief uit te voeren wanneer grote aantallen van de verschillende cellen moeten gelijktijdig worden vergeleken van voorlopercellen activiteiten. Ten tweede, onze semi-vaste media maakt gelijkmatige verdeling van de extracellulaire matrix componenten en groeifactoren, die het mogelijk maakt zowel de proliferatie en differentiatie plaatsvinden in dezelfde put. In tegenstelling, is het moeilijker om een ​​dergelijke omgeving, in het bijzonder de matrix, te verstrekken aan cellen in suspensie cultuur. We zijn ons bewust dat met onze methode niet kan definitief worden bewezen dat elke kolonie is afgeleid van een enkele cel, als twee voorouders kunnen willekeurig worden geplaatst bij elkaar en vormen een kolonie. Echter, kan dit probleem worden overwonnen door secundaire analyse met behulp van enkele cel manipulatie. Direct met de hand plukken van de gesorteerde losse cellen zou kunnen definitief aan te tonen van de enkele cel oorsprong van elk kolonie. Kortom, de insuline-expressie kolonie vormende activiteit van de progenitors in semi-vaste media hierin beschreven biedt unieke mogelijkheden voor mechanistische studies van de pancreas voorlopercellen op het enkele cel-niveau. Bijvoorbeeld, in een voorafgaand verslag vonden we dat de toevoeging van Matrigel, een ruwe mengsel van extracellulaire matrix eiwitten, in de cultuur media is nodig voor de vorming van de insuline-expressie kolonies van Ngn3-EGFP + cellen, 2 suggereert dat de extracellulaire matrix is belangrijk voor de voorlopers. Met behulp van deze kolonie-test, wordt het nu mogelijk om verder te ontleden en specifieke matrix eisen voor dergelijke activiteiten te definiëren. Naast het bestuderen van voorlopercellen uit muis embryonale stamcellen, zijn we momenteel onderzoeken of dit in vitro test systeem ook de vorming van andere kenmerkende kolonies afgeleid van de pancreas en de lever van de perinatale en volwassen muizen, maar ook van menselijke dode pancreas weefsel verstoken ondersteunt van de eilandjes.

<table border="1"><tbody><tr><td> Materiaal / Reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus Aantal </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> 1X DMEM / F-12 (01:01) </td><td> Mediatech </td><td> 15-090-CV </td><td></td></tr><tr><td> Fetal Calf Serum </td><td> Tissue Culture Biologicals </td><td> 201 </td><td> Zie sectie 1.1 </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Gibco </td><td> 25030-081 </td><td></td></tr><tr><td> 1X Dulbecco&#39;s PBS </td><td> Mediatech </td><td> 21-031-CV </td><td></td></tr><tr><td> Bovine Serum Albumine </td><td> Sigma </td><td> A8412 </td><td> 7,5% </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> Becton Dickinson </td><td> 356231 </td><td> Verminderde groei Factor </td></tr><tr><td> Methylcellulose </td><td> Sinetsu Chemische, Tokyo, Japan </td><td></td><td> 1500 centipoise (High-viscosity) </td></tr><tr><td> Nicotinamide </td><td> Sigma </td><td> N0636 </td><td></td></tr><tr><td> Menselijk Recombinant Activine βB </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 659-AB-025 </td><td></td></tr><tr><td> Exendin-4 </td><td> Sigma </td><td> E7144 </td><td></td></tr><tr><td> Menselijk Recombinant VEGF-A </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 293-VE-010 </td><td></td></tr><tr><td> 24-well platen </td><td> Costar </td><td> 3473 </td><td> Ultra-low Gehechtheid </td></tr><tr><td> 60mm Petri Dish met Grid </td><td> Nunc </td><td> 169558 </td><td></td></tr></tbody></table>

a quantitative assay for insulin-expressing colony-forming progenitors

Het gebied van de alvleesklier stam en progenitor celbiologie werd belemmerd door een gebrek aan in vitro functionele en kwantitatieve bepalingen die het mogelijk maken voor de analyse van de enkele cel. Analyses van enkele voorlopers zijn van cruciaal belang omdat zij de definitieve manieren om ondubbelzinnig aan te tonen de afstamming potentieel van de individuele voorouders. Hoewel de methoden zijn ontwikkeld om &quot;pancreatospheres&quot; in suspensie cultuur van enkelvoudige cellen te genereren, een aantal beperkingen bestaan. Ten eerste, het is tijdrovend om uit te voeren enkele cel depositie voor een groot aantal cellen, die op hun beurt commando&#39;s grote hoeveelheden van cultuur media en ruimte. Ten tweede, nummering van de resulterende pancreatospheres is arbeidsintensief, vooral wanneer de frequentie van de pancreatosphere-initiëren van voorlopercellen laag is. Ten derde, de pancreatosphere test is niet een efficiënte methode om zowel de proliferatie en differentiatie van de pancreas voorlopercellen in dezelfde cultuur goed, restricting het nut van de test. Om deze beperkingen, is een semi-vaste media op basis van kolonie test voor de pancreatische voorlopers is ontwikkeld en wordt gepresenteerd in dit rapport. Deze methode maakt gebruik van een bestaand concept uit de hematopoietische kolonie test, waarbij methylcellulose wordt gebruikt om de viscositeit te verstrekken aan de media, waardoor de progenitorcellen voor een verblijf in drie-dimensionale ruimte als ze ondergaan proliferatie en differentiatie. Te verrijken insuline-expressie kolonievormende voorlopercellen uit een heterogene populatie, hebben we gebruik gemaakt cellen die uitdrukken neurogenin (NGN) 3, een pancreas endocriene progenitor cel marker. Muriene embryonale stamcellen (ES) uit de cel afkomstige Ngn3 expressie brengende cellen gelabeld met de verbeterde groen fluorescent eiwit reporter werden gesorteerd en maar liefst 25.000 cellen per well werden uitgeplaat in low-attachment 24-well cultuur gerechten. Elk putje bevatte 500 pi van semi-vaste media met de volgende belangrijke componenten: voldaanhylcellulose, Matrigel, nicotinamide, exendin-4, activine βB en geconditioneerde media verzameld van muriene embryonale stamcellen afgeleide alvleesklier-achtige cellen. Na 8 tot 12 dagen van cultuur, insuline-expressie kolonies met kenmerkende morfologie werden gevormd en kan verder worden geanalyseerd voor de pancreas genexpressie met behulp van kwantitatieve RT-PCR en immunoflourescent vlekken op de afstamming samenstelling van elke kolonie te bepalen. Kortom, onze kolonie test maakt een eenvoudige detectie en kwantificering van functionele voorouders binnen een heterogene populatie van cellen. Daarnaast is de semi-vaste media formaat maakt uniforme presentatie van de extracellulaire matrix componenten en groeifactoren aan cellen, waardoor progenitors te laten groeien en differentiëren in vitro. Deze kolonie test biedt unieke mogelijkheden voor mechanistische studies van pancreatische progenitorcellen bij de enkele cel niveau.

Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors at JoVE.com

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

Een drie-dimensionale Monogene assay die het mogelijk maakt de pancreas-achtige voorouders om te differentiëren in de insuline-expressie kolonies is beschreven. Deze methode maakt gebruik van semi-vaste media met methylcellulose, Matrigel en groeifactoren, waarin de afzonderlijke progenitors prolifereren en differentiëren<em&gt; In vitro</em&gt;, Waardoor de kwantificering van het aantal functionele voorouders in een populatie.

Een kwantitatieve test voor insuline-expressie Kolonie-vormende voorouders

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Kwantitatieve Phosphoproteomics in Fatty Acid Gestimuleerd Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

Isolatie en grootschalige expansie van volwassen humane endotheelcellen kolonievormende Progenitor Cellen

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

Isolatie en dierlijk serum vrije expansie van de mens navelstreng Afgeleid Mesenchymale stromale cellen (MSC&#39;s) en Endotheliale Colony Forming progenitor cellen (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

Identificatie en analyse van de muis erytroïde voorouders met behulp van de CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood

Fenotypische en functionele karakterisering van endotheliale Colony Forming Cellen uit menselijk navelstrengbloed

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Een kwantitatieve analyse Fitness Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Een High Throughput MHC II Bindingsassay voor de kwantitatieve analyse van peptide-epitopen

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Een strategie voor de gevoelige, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Kwantitatieve immunofluorescentiebepaling op het Variatie in eiwitgehalten op centrosomes Maatregel

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

Ontwikkeling van een kwantitatieve Recombinase Polymerase Amplificatie test met een interne positieve controle

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...