Name: a quantitative assay for insulin-expressing colony-forming progenitors
Uploaded: 2011-11-28T12:00:00
Duration: 14 min 39 s
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Les auteurs tiennent à remercier le Dr Klaus Kaestner pour le don du murin Ngn3-EGFP ligne de cellules souches embryonnaires, Mme Lucy Brown et le Core cytométrie analytique de l&#39;aide pour le tri cellulaire. Ce travail a été financé en partie par des subventions du NIH et de R21DK069997 R01DK081587 décerné à HTK et de California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) bourses de formation accordées aux MW et LS

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	<li>Ku, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Committing+embryonic+stem+cells+to+early+endocrine+pancreas+in+vitro.">Committing embryonic stem cells to early endocrine pancreas in vitro.</a> Stem cells. 22, 1205-1217 (2004).</li><li>Ku, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-expressing+colonies+developed+from+murine+embryonic+stem+cell-derived+progenitors.">Insulin-expressing colonies developed from murine embryonic stem cell-derived progenitors.</a> Diabetes. 56, 921-929 (2007).</li><li>Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+in+vitro+differentiation+assay+for+pancreatic-like+cell+development+from+murine+embryonic+stem+cells:+detailed+gene+expression+analysis.">Characterization of an in vitro differentiation assay for pancreatic-like cell development from murine embryonic stem cells: detailed gene expression analysis.</a> Assay. Drug. Dev. Technol. 9, 403-419 (2011).</li><li>Lee, C. S., Perreault, N., Brestelli, J. E., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenin+3+is+essential+for+the+proper+specification+of+gastric+enteroendocrine+cells+and+the+maintenance+of+gastric+epithelial+cell+identity.">Neurogenin 3 is essential for the proper specification of gastric enteroendocrine cells and the maintenance of gastric epithelial cell identity.</a> Genes. 16, 1488-1497 (2002).</li><li>Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+the+pancreatic+lineage:+NGN3++cells+are+islet+progenitors+and+are+distinct+from+duct+progenitors.">Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors.</a> Development. 129, 2447-2457 (2002).</li><li>Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+proliferation+of+hematopoietic+stem+cells.">Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells.</a> Blood. 81, 2844-2853 (1993).</li><li>Gittes, G. K., Galante, P. E., Hanahan, D., Rutter, W. J., Debase, H. 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J., Rabinovitch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy+with+epidermal+growth+factor+and+gastrin+induces+neogenesis+of+human+islet+beta-cells+from+pancreatic+duct+cells+and+an+increase+in+functional+beta-cell+mass.">Combination therapy with epidermal growth factor and gastrin induces neogenesis of human islet beta-cells from pancreatic duct cells and an increase in functional beta-cell mass.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 90, 3401-3409 (2005).</li><li>Hao, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-cell+differentiation+from+nonendocrine+epithelial+cells+of+the+adult+human+pancreas.">Beta-cell differentiation from nonendocrine epithelial cells of the adult human pancreas.</a> Nature Medicine. 12, 310-316 (2006).</li><li>Ku, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+pancreatic+progenitor+cells--recent+studies.">Minireview: pancreatic progenitor cells--recent studies.</a> Endocrinology. 149, 4312-4316 (2008).</li><li>Seaberg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+identification+of+multipotent+precursors+from+adult+mouse+pancreas+that+generate+neural+and+pancreatic+lineages.">Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages.</a> Nature Biotechnology. 22, 1115-1124 (2004).</li><li>Rovira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+centroacinar/terminal+ductal+progenitor+cells+in+adult+mouse+pancreas.">Isolation and characterization of centroacinar/terminal ductal progenitor cells in adult mouse pancreas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 75-80 (2010).</li></ol>

Nous n&#39;avons rien à révéler.

Colony dosages qui permettent des évaluations quantitatives et fonctionnelles des progéniteurs pancréatiques individuels ont été limités jusqu&#39;ici, ce qui a grandement entravé les progrès dans les études des souches pancréatiques et la biologie de cellules progénitrices. L&#39;essence d&#39;un dosage de la colonie, c&#39;est qu&#39;il mesure la capacité intrinsèque des cellules progénitrices, plutôt qu&#39;uniquement de leur phénotype, permettant à la fonctionnalité et le potentiel lignée des cellules progénitrices d&#39;être observé. Il est également un outil quantitatif qui peut déterminer le nombre de progéniteurs dans une population donnée. Dans le domaine des cellules souches hématopoïétiques, des dosages colonie ont joué un rôle important dans l&#39;identification, ainsi que déchiffrer les exigences du facteur de croissance, des interactions et des mécanismes régissant l&#39;engagement de la lignée de ces cellules. 6 Dans le domaine de la biologie des cellules pancréatiques progénitrices, 7 organes du pancréas , 8 ou 9 à 13 en vrac cultures ont été imaginés, toutefois, de tels dosages biologiques ne traitent pas questions au niveau de la cellule unique. Sans analyses cellule unique, l&#39;existence de souches pancréatiques multi-potentiels / progéniteurs ne peut être prouvé sans équivoque 14. Ici, nous montrons que l&#39;insuline exprimant formant colonie progéniteurs peuvent être analysés en utilisant un modèle tridimensionnel, Matrigel contenant, système de culture semi-solide. Bien qu&#39;un système de culture en suspension 15,16 a été développé qui permet seule progéniteurs pancréatiques adultes à proliférer et se différencier en &quot;pancreatospheres&quot;, notre test colonie offre des avantages supplémentaires. Premièrement, notre semi-solide culture médiatique système permet le placage de jusqu&#39;à 25.000 cellules triées par 500 ul par les milieux de culture de 24 puits tout en maintenant la formation de colonies résultant de la gamme linéaire. 2 En revanche, le dosage pancreatosphere suspension nécessite l&#39;utilisation d&#39;une seule méthode de dépôt de cellules de la trieuse de cellules pour permettre des analyses cellule unique, et donc un volume plus important de la culture médiatique et de l&#39;espace incubateursont nécessaires. Par conséquent, notre analyse colonie est relativement facile et rentable d&#39;effectuer lorsqu&#39;un grand nombre de cellules différentes doivent être comparées simultanément à des activités progénitrices. Deuxièmement, notre semi-solide de médias permet une distribution uniforme des composants de la matrice extracellulaire et les facteurs de croissance, ce qui permet à la fois la prolifération et de différenciation de se produire dans le même puits. En revanche, il est plus difficile de fournir un tel environnement, en particulier la matrice, à des cellules en culture en suspension. Nous sommes conscients que notre méthode ne peut pas être définitivement prouvé que chaque colonie est dérivé d&#39;une seule cellule, comme deux progéniteurs peuvent être positionnés au hasard près de l&#39;autre et forment une colonie. Toutefois, ce problème peut être surmonté par une analyse secondaire en utilisant la manipulation seule cellule. Direct cueillette manuelle des cellules triées unique pourrait définitivement démontrer l&#39;origine cellule unique de chaque colonie. En résumé, l&#39;insuline exprimant formant colonie activité de progéniteurs dans les milieux semi-solides décrite ici fournit des occasions uniques pour des études mécanistiques des progéniteurs pancréatiques au niveau cellulaire unique. Par exemple, dans un rapport antérieur, nous avons trouvé que l&#39;ajout de Matrigel, un mélange brut de protéines de la matrice extracellulaire, dans la culture des médias est nécessaire pour la formation de l&#39;insuline par les cellules exprimant colonies + Ngn3-EGFP, 2 suggérant la matrice extracellulaire est important pour ceux progéniteurs. L&#39;utilisation de ce test colonie, il sera désormais possible de disséquer et de définir les exigences spécifiques de matrice pour une telle activité. En plus d&#39;étudier les progéniteurs des cellules dérivées de souches embryonnaires de souris, nous étudions actuellement si ce système de test in vitro soutient également la formation d&#39;autres colonies distinctes provenant du pancréas et du foie de souris en périnatalité et pour adultes, ainsi que du tissu pancréatique humain cadavérique dénuée d&#39;îlots.

<table border="1"><tbody><tr><td> Matériel / Réactif </td><td> Société </td><td> Catalogue Nombre </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> 1X DMEM / F-12 (01:01) </td><td> Mediatech </td><td> 15 à 090-CV </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de veau foetal </td><td> Tissue Culture Biologicals </td><td> 201 </td><td> Se reporter à la section 1.1 </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Gibco </td><td> 25030-081 </td><td></td></tr><tr><td> 1X PBS Dulbecco </td><td> Mediatech </td><td> 21 à 031-CV </td><td></td></tr><tr><td> De sérum bovin Albumine </td><td> Sigma </td><td> A8412 </td><td> 7,5% </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> Becton Dickinson </td><td> 356231 </td><td> Croissance réduite Facteur </td></tr><tr><td> Méthylcellulose </td><td> Sinetsu Chimique, Tokyo, Japon </td><td></td><td> 1500 centipoises (Haute viscosity) </td></tr><tr><td> Nicotinamide </td><td> Sigma </td><td> N0636 </td><td></td></tr><tr><td> Homme Recombinant Activine ßB </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 659-AB-025 </td><td></td></tr><tr><td> Exendin-4 </td><td> Sigma </td><td> E7144 </td><td></td></tr><tr><td> Homme Recombinant Le VEGF-A </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 293-VE-010 </td><td></td></tr><tr><td> Plaques à 24 puits </td><td> Costar </td><td> 3473 </td><td> Ultra-faible Pièce jointe </td></tr><tr><td> 60mm boîte de Pétri avec grille </td><td> Nunc </td><td> 169558 </td><td></td></tr></tbody></table>

a quantitative assay for insulin-expressing colony-forming progenitors

Le domaine de souches pancréatiques et la biologie de cellules progénitrices ont été entravés par un manque d&#39;essais in vitro fonctionnelles et quantitatives qui permettent l&#39;analyse de la cellule unique. Analyses des progéniteurs simples sont d&#39;une importance cruciale car elles fournissent des moyens définitive à démontrer sans équivoque le potentiel lignée des progéniteurs individuels. Bien que les méthodes ont été conçues pour générer des «pancreatospheres&quot; en culture en suspension de cellules uniques, plusieurs limitations existent. Premièrement, il est temps pour réaliser le dépôt cellule unique pour un grand nombre de cellules qui, à son tour les commandes de gros volumes de milieux de culture et de l&#39;espace. Deuxièmement, la numération de l&#39;pancreatospheres qui en résulte est une main-d&#39;œuvre, surtout lorsque la fréquence des progéniteurs pancreatosphere-initiation est faible. Troisièmement, le dosage pancreatosphere n&#39;est pas une méthode efficace pour permettre à la fois la prolifération et la différenciation des progéniteurs du pancréas dans la même culture et, à nouveaustricting l&#39;utilité du dosage. Pour surmonter ces limitations, un dosage de milieux semi-solides pour la colonie basée progéniteurs pancréatiques a été élaboré et est présentée dans ce rapport. Cette méthode tire parti d&#39;un concept existant à partir du dosage de colonies hématopoïétiques, dans lequel la méthylcellulose est utilisé pour fournir viscosité pour les médias, permettant les cellules progénitrices de rester dans un espace tridimensionnel car ils subissent la prolifération ainsi que la différenciation. Pour enrichir l&#39;insuline exprimant formant colonie progéniteurs d&#39;une population hétérogène, nous avons utilisé les cellules qui expriment Neurogenin (NGN) 3, un pancréas endocrine de cellules progénitrices marqueur. Murin souches embryonnaires (ES) dérivés de cellules Ngn3 cellules exprimant taggés avec le journaliste améliorée protéine fluorescente verte ont été triés et autant que 25 000 cellules par puits ont été étalées dans peu d&#39;attachement des boîtes de culture de 24 puits. Chaque puits contenait 500 ul de milieux semi-solides avec les principaux éléments suivants: a rencontréhylcellulose, Matrigel, la nicotinamide, Exendin-4, activine ßB, et des milieux conditionnés provenant murines ES dérivées de cellules pancréatiques, comme des cellules. Après 8 à 12 jours de culture, de l&#39;insuline exprimant colonies ayant une morphologie distinctive ont été formés et pourrait encore être analysés pour l&#39;expression des gènes du pancréas en utilisant RT-PCR quantitative et coloration immunoflourescent pour déterminer la composition lignée de chaque colonie. En résumé, notre analyse permet de détecter facilement la colonie et la quantification des progéniteurs fonctionnelle au sein d&#39;une population hétérogène de cellules. En outre, le format de milieux semi-solides permet une présentation uniforme des composants de la matrice extracellulaire et les facteurs de croissance pour les cellules, permettant progéniteurs à proliférer et à se différencier in vitro. Ce test fournit la colonie des opportunités uniques pour des études mécanistiques des cellules progénitrices du pancréas au niveau de la cellule unique.

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A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

Un test en trois dimensions qui permet clonogénique pancréatique comme géniteurs à se différencier en insuline exprimer colonies est décrite. Cette méthode tire parti des milieux semi-solides contenant des facteurs de la méthylcellulose, Matrigel et la croissance, dans lequel seule progéniteurs prolifèrent et se différencient<em&gt; In vitro</em&gt;, Qui permet la quantification du nombre de progéniteurs fonctionnelle dans une population.

Un dosage quantitatif de l&#39;insuline exprimer formant colonie Progéniteurs

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