Name: a quantitative assay for insulin-expressing colony-forming progenitors
Uploaded: 2011-11-28T12:00:00
Duration: 14 min 39 s
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Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Klaus Kaestner per il dono della murino Ngn3-EGFP linea di cellule staminali embrionali, la signora Lucy Brown e il Core citometria analitica per l&#39;assistenza nello smistamento delle cellule. Questo lavoro è stato finanziato in parte da sovvenzioni NIH R21DK069997 e R01DK081587 assegnato a HTK e dalla California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) borse di formazione assegnati a MW e LS

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	<li>Ku, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Committing+embryonic+stem+cells+to+early+endocrine+pancreas+in+vitro.">Committing embryonic stem cells to early endocrine pancreas in vitro.</a> Stem cells. 22, 1205-1217 (2004).</li><li>Ku, H. 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Non abbiamo nulla da rivelare.

Saggi di colonia che permettono una valutazione quantitativa e funzionale di cellule progenitrici del pancreas singoli sono stati limitati finora, che ha notevolmente ostacolato il progresso negli studi di staminali pancreatiche e biologia delle cellule progenitrici. L&#39;essenza di una colonia è saggio che misura la capacità intrinseca delle cellule progenitrici, e non solo loro fenotipo, permettendo la funzionalità e le potenzialità lignaggio delle cellule progenitrici da osservare. E &#39;anche uno strumento quantitativo che può determinare il numero di progenitori in una data popolazione. Nel campo delle cellule staminali ematopoietiche, saggi di colonia hanno avuto un ruolo importante nella identificazione, così come decifrare i requisiti di fattori di crescita, interazioni e dei meccanismi che regolano l&#39;impegno lignaggio di queste cellule. 6 Nel campo della biologia delle cellule progenitrici del pancreas, organo del pancreas 7 , 8 o alla rinfusa culture 13/09 sono stati ideati, tuttavia, tali dosaggi non affrontano biologico Questi,ons a livello di singola cellula. Senza analisi di singola cellula, l&#39;esistenza di multi-potenzialità staminali pancreatiche / progenitori non può essere dimostrata in modo inequivocabile. 14 Qui mostriamo che l&#39;insulina che esprimono formanti colonia progenitori possono essere analizzati utilizzando una tridimensionale, Matrigel contenenti semi-solido sistema di coltura. Anche se un sistema di coltura sospensione 15,16 è stata sviluppata che permette singolo progenitori pancreatici adulti di proliferare e differenziarsi in &quot;pancreatospheres&quot;, il nostro test colonia offre ulteriori vantaggi. In primo luogo, la nostra semi-solido sistema di cultura mediatica permette di placcatura fino a 25.000 cellule ordinati per 500 terreni di coltura per 24 microlitri bene mantenendo la conseguente formazione di colonie nel range lineare. 2 Al contrario, il saggio pancreatosphere sospensione richiede l&#39;uso di singolo deposizione metodo delle celle dal cell sorter per consentire analisi di singola cellula, e quindi un maggior volume di cultura media e incubatore spaziosono obbligatori. Pertanto, il nostro saggio colonia è relativamente facile e conveniente per condurre quando un gran numero di cellule differenti devono essere confrontati contemporaneamente per le attività delle cellule progenitrici. In secondo luogo, la nostra semi-solido dei media consente una distribuzione uniforme dei componenti della matrice extracellulare e fattori di crescita, che consente sia la proliferazione e la differenziazione avvenga nel pozzo stesso. Al contrario, è più difficile fornire un ambiente del genere, specialmente la matrice, di cellule in coltura sospensione. Siamo consapevoli che con il nostro metodo non può essere definitivamente provato che ogni colonia è derivata da una singola cellula, come due progenitori possono essere posizionate in modo casuale vicini l&#39;uno all&#39;altro e formano una colonia. Tuttavia, questo problema può essere superato attraverso l&#39;analisi secondaria utilizzando la manipolazione singola cella. Diretto la raccolta manuale delle singole cellule ordinati potrebbe definitivamente dimostrare l&#39;origine singola cella di ogni colonia. In sintesi, l&#39;insulina che esprimono formanti colonia attività di progenitors in semi-solido dei media descritto nel presente documento offre opportunità uniche per studi meccanicistici di cellule progenitrici del pancreas a livello di singola cellula. Per esempio, in un rapporto precedente abbiamo trovato che l&#39;aggiunta di Matrigel, una miscela grezza di proteine ​​della matrice extracellulare, nella cultura dei media è necessario per la formazione di insulina che esprimono colonie da Ngn3-cellule EGFP +, 2 suggerendo la matrice extracellulare è importante per quei progenitori. Da questo test colonia, sarà ora possibile analizzare ulteriormente e definire i requisiti matrice specifica per tale attività. Oltre a studiare progenitrici derivate da cellule staminali embrionali di topo, stiamo attualmente studiando se questo sistema di analisi in vitro supporta anche la formazione di altre colonie distintivo derivato dal pancreas e nel fegato di topi perinatale e adulti, così come da tessuto pancreatico umano cadavere privo di isolotti.

<table border="1"><tbody><tr><td> Materiale / Reagente </td><td> Azienda </td><td> Catalogo Numero </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> DMEM 1X / F-12 (1:1) </td><td> Mediatech </td><td> 15-090-CV </td><td></td></tr><tr><td> Siero di vitello fetale </td><td> Tissue Culture Biologicals </td><td> 201 </td><td> Consultare la Sezione 1,1 </td></tr><tr><td> L-glutammina </td><td> Gibco </td><td> 25030-081 </td><td></td></tr><tr><td> 1X PBS Dulbecco </td><td> Mediatech </td><td> 21-031-CV </td><td></td></tr><tr><td> Siero bovino Albumina </td><td> Sigma </td><td> A8412 </td><td> 7,5% </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> Becton Dickinson </td><td> 356231 </td><td> Crescita ridotta Fattore </td></tr><tr><td> Metilcellulosa </td><td> Sinetsu Chimica, Tokyo, Giappone </td><td></td><td> 1.500 centipoise (High-viscosity) </td></tr><tr><td> Nicotinamide </td><td> Sigma </td><td> N0636 </td><td></td></tr><tr><td> Umano Ricombinante Activin βB </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 659-AB-025 </td><td></td></tr><tr><td> Exendin-4 </td><td> Sigma </td><td> E7144 </td><td></td></tr><tr><td> Umano Ricombinante VEGF-A </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 293-VE-010 </td><td></td></tr><tr><td> 24-pozzetti </td><td> Co-star </td><td> 3473 </td><td> Ultra-low Attaccamento </td></tr><tr><td> 60 millimetri Petri Dish con griglia </td><td> Nunc </td><td> 169558 </td><td></td></tr></tbody></table>

a quantitative assay for insulin-expressing colony-forming progenitors

Il campo di staminali pancreatiche e biologia delle cellule progenitrici è stata ostacolata dalla mancanza di test in vitro funzionali e quantitativi che consentono l&#39;analisi della singola cellula. Le analisi di singoli progenitori sono di importanza fondamentale in quanto forniscono modi definitiva per dimostrare in modo inequivocabile il potenziale stirpe dei progenitori individuali. Anche se i metodi sono stati studiati per generare &quot;pancreatospheres&quot; nella cultura sospensione da singole cellule, esistono diverse limitazioni. In primo luogo, è tempo per eseguire la deposizione singola cellula per un gran numero di cellule, che a sua volta comandi di grandi volumi di terreni di coltura e dello spazio. In secondo luogo, numerazione delle pancreatospheres risultante è alta intensità di lavoro, specialmente quando la frequenza del pancreatosphere-inizio progenitori è bassa. In terzo luogo, il test pancreatosphere non è un metodo efficace per consentire sia la proliferazione e la differenziazione di cellule progenitrici del pancreas nella stessa cultura e, ristricting l&#39;utilità del test. Per superare queste limitazioni, un semi-solido saggio colonia dei media based per progenitori del pancreas è stato sviluppato e viene presentato in questo rapporto. Questo metodo si avvale di un concetto esistente dal saggio colonia ematopoietiche, in cui viene utilizzato metilcellulosa per fornire ai media viscosità, permettendo alle cellule progenitrici di soggiornare in uno spazio tridimensionale che subiscono la proliferazione e differenziazione. Per arricchire l&#39;insulina che esprimono formanti colonia progenitori da una popolazione eterogenea, abbiamo utilizzato le cellule che esprimono neurogenina (NGN) 3, un marcatore del pancreas endocrino delle cellule progenitrici. Staminali di embrioni murini (ES) derivati ​​dalle cellule Ngn3 cellule che esprimono taggati con la maggiore giornalista proteina fluorescente verde sono stati ordinati e ben 25.000 cellule per pozzetto sono stati placcati in basso attaccamento 24-bene i piatti della cultura. Ogni pozzetto conteneva 500 microlitri di semi-solido dei media con i seguenti componenti principali: ha incontratohylcellulose, Matrigel, nicotinamide, exendin-4, activina βB e mezzo condizionato raccolti da topo ES derivati ​​dalle cellule pancreatiche-come le cellule. Dopo 8 a 12 giorni di cultura, insulino-esprimendo le colonie con morfologia distintivi sono formati e potrebbe essere ulteriormente analizzati per l&#39;espressione del gene del pancreas con RT-PCR quantitativa e colorazione immunoflourescent per determinare la composizione lignaggio di ogni colonia. In sintesi, il nostro saggio colonia permette la facile individuazione e quantificazione dei progenitori funzionale all&#39;interno di una popolazione eterogenea di cellule. Inoltre, il semi-solido formato multimediale permette di presentazione uniforme dei componenti della matrice extracellulare e fattori di crescita per le cellule, permettendo progenitori di proliferare e differenziarsi in vitro. Questo test colonia offre opportunità uniche per gli studi meccanicistici delle cellule progenitrici del pancreas a livello di singola cellula.

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A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

Un tridimensionale test clonogenica che permette pancreatico-come progenitori di differenziarsi in insulino-colonie che esprimono è descritto. Questo metodo si avvale di semi-solidi supporti contenenti fattori di metilcellulosa, Matrigel e di crescita, in cui progenitori singolo proliferare e differenziarsi<em&gt; In vitro</em&gt;, Permettendo la quantificazione del numero di cellule progenitrici funzionale in una popolazione.

Un dosaggio quantitativo di insulina che esprimono formante colonia Progenitori

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