Name: a quantitative assay for insulin-expressing colony-forming progenitors
Uploaded: 2011-11-28T12:00:00
Duration: 14 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Клауса Kaestner за дар мышиной Ngn3-EGFP эмбриональных стволовых клеток, г-жа Люси Браун и аналитической Основные цитометрии для помощи в сортировки клеток. Эта работа была частично финансируется грантами NIH R21DK069997 и R01DK081587 присужден HTK и из Калифорнийского института регенеративной медицины (CIRM) обучение гранты присуждены МВт и LS

<ol>
	<li>Ku, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Committing+embryonic+stem+cells+to+early+endocrine+pancreas+in+vitro.">Committing embryonic stem cells to early endocrine pancreas in vitro.</a> Stem cells. 22, 1205-1217 (2004).</li><li>Ku, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-expressing+colonies+developed+from+murine+embryonic+stem+cell-derived+progenitors.">Insulin-expressing colonies developed from murine embryonic stem cell-derived progenitors.</a> Diabetes. 56, 921-929 (2007).</li><li>Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+in+vitro+differentiation+assay+for+pancreatic-like+cell+development+from+murine+embryonic+stem+cells:+detailed+gene+expression+analysis.">Characterization of an in vitro differentiation assay for pancreatic-like cell development from murine embryonic stem cells: detailed gene expression analysis.</a> Assay. Drug. Dev. Technol. 9, 403-419 (2011).</li><li>Lee, C. S., Perreault, N., Brestelli, J. E., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenin+3+is+essential+for+the+proper+specification+of+gastric+enteroendocrine+cells+and+the+maintenance+of+gastric+epithelial+cell+identity.">Neurogenin 3 is essential for the proper specification of gastric enteroendocrine cells and the maintenance of gastric epithelial cell identity.</a> Genes. 16, 1488-1497 (2002).</li><li>Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+the+pancreatic+lineage:+NGN3++cells+are+islet+progenitors+and+are+distinct+from+duct+progenitors.">Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors.</a> Development. 129, 2447-2457 (2002).</li><li>Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+proliferation+of+hematopoietic+stem+cells.">Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells.</a> Blood. 81, 2844-2853 (1993).</li><li>Gittes, G. K., Galante, P. E., Hanahan, D., Rutter, W. J., Debase, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-specific+morphogenesis+in+the+developing+pancreas:+role+of+mesenchymal+factors.">Lineage-specific morphogenesis in the developing pancreas: role of mesenchymal factors.</a> Development. 122, 439-447 (1996).</li><li>Miralles, F., Battelino, T., Czernichow, P., Scharfmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+plays+a+key+role+in+morphogenesis+of+the+pancreatic+islets+of+Langerhans+by+controlling+the+activity+of+the+matrix+metalloproteinase+MMP-2.">TGF-beta plays a key role in morphogenesis of the pancreatic islets of Langerhans by controlling the activity of the matrix metalloproteinase MMP-2.</a> J. Cell. Biol. 143, 827-836 (1998).</li><li>Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cultivation+of+human+islets+from+expanded+ductal+tissue.">In vitro cultivation of human islets from expanded ductal tissue.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 7999-8004 (2000).</li><li>Gao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+endocrine+progenitor+cells+and+critical+factors+for+their+differentiation+in+human+adult+pancreatic+cell+culture.">Characterization of endocrine progenitor cells and critical factors for their differentiation in human adult pancreatic cell culture.</a> Diabetes. 52, 2007-2015 (2003).</li><li>Gao, R., Ustinov, J., Korsgren, O., Otonkoski, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+neogenesis+of+human+islets+reflects+the+plasticity+of+differentiated+human+pancreatic+cells.">In vitro neogenesis of human islets reflects the plasticity of differentiated human pancreatic cells.</a> Diabetologia. 48, 2296-2304 (2005).</li><li>Suarez-Pinzon, W. L., Lakey, J. R., Brand, S. J., Rabinovitch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy+with+epidermal+growth+factor+and+gastrin+induces+neogenesis+of+human+islet+beta-cells+from+pancreatic+duct+cells+and+an+increase+in+functional+beta-cell+mass.">Combination therapy with epidermal growth factor and gastrin induces neogenesis of human islet beta-cells from pancreatic duct cells and an increase in functional beta-cell mass.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 90, 3401-3409 (2005).</li><li>Hao, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-cell+differentiation+from+nonendocrine+epithelial+cells+of+the+adult+human+pancreas.">Beta-cell differentiation from nonendocrine epithelial cells of the adult human pancreas.</a> Nature Medicine. 12, 310-316 (2006).</li><li>Ku, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+pancreatic+progenitor+cells--recent+studies.">Minireview: pancreatic progenitor cells--recent studies.</a> Endocrinology. 149, 4312-4316 (2008).</li><li>Seaberg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+identification+of+multipotent+precursors+from+adult+mouse+pancreas+that+generate+neural+and+pancreatic+lineages.">Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages.</a> Nature Biotechnology. 22, 1115-1124 (2004).</li><li>Rovira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+centroacinar/terminal+ductal+progenitor+cells+in+adult+mouse+pancreas.">Isolation and characterization of centroacinar/terminal ductal progenitor cells in adult mouse pancreas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 75-80 (2010).</li></ol>

Нам нечего раскрывать.

Колония анализов, позволяющих получить количественную и функциональную оценку отдельных прародителей поджелудочной железы были ограничены до сих пор, что значительно препятствует прогрессу в исследованиях стволовых поджелудочной железы и биологии клеток-предшественников. Сущность колонии анализа является то, что он измеряет внутреннюю способность клеток-предшественников, а не только их фенотип, что позволяет функциональные возможности и потенциалы линии клеток-предшественников, которые необходимо соблюдать. Кроме того, количественный инструмент, который может определить количество предшественников в данной популяции. В поле гемопоэтических стволовых клеток, колонии тесты играли важную роль в идентификации, а также расшифровка фактор роста требований, взаимодействия и механизмы, регулирующие происхождение приверженность этих клеток. 6 В области поджелудочной предшественников клеточной биологии, поджелудочной орган 7 , 8 или массовых культур 9-13 были разработаны, однако, такие тесты не учитывают биологические questiдополнения на одном уровне клетки. Без одного анализа клетки, существование нескольких потенциальных стволовых поджелудочной железы / прародителей не может быть доказано однозначно. 14 Здесь мы показываем, что инсулин, экспрессирующих колониеобразующих предшественники могут быть проанализированы использованием трехмерной, Матригель содержащих, полутвердых и региональные параметры системы. Хотя подвеска 15,16 культуры была разработана, которая позволяет одним взрослым поджелудочной прародителей размножаться и дифференцироваться в &quot;pancreatospheres&quot;, наши колонии препарат обеспечивает дополнительные преимущества. Во-первых, наши полутвердых медиакультуры система позволяет покрытие до 25000 отсортированных клеток на 500 мкл культуральной среды в 24-а, сохраняя при этом в результате образования колоний в линейном диапазоне. 2 В отличие от анализа подвески pancreatosphere требует использования одного клетка осаждения методом из клетки сортировщик, чтобы один анализ клетки, и таким образом большего объема питательных сред и инкубатором пространстваобязательны для заполнения. Таким образом, наша колония анализа относительно легко и экономически эффективно проводить, когда большое количество различных клеток необходимо сравнить одновременно для предшественников деятельности. Во-вторых, наши полутвердых СМИ позволяет равномерное распределение компонентов внеклеточного матрикса и факторов роста, который позволяет не только пролиферации и дифференцировки происходит в той же скважине. С другой стороны, труднее обеспечить такую ​​окружающую среду, особенно матрицы, для клеток в суспензии культуры. Мы понимаем, что с помощью нашего метода не может быть окончательно доказано, что каждая колония является производным от одной клетки, как две прародителей может быть случайно расположенных рядом друг с другом и образуют одну колонию. Тем не менее, эта проблема может быть преодолена путем вторичного анализа с помощью одной манипуляции клетки. Прямой ручной отборки отсортированы отдельные клетки могут окончательно продемонстрировать единое происхождение ячейке каждой колонии. Таким образом, инсулин выражения колониеобразующих деятельности проgenitors в полу-твердых средах, описанных здесь предоставляются уникальные возможности для механистические исследования панкреатических предшественников на одном уровне клетки. Например, в предыдущем докладе мы обнаружили, что добавление Матригель, сырой смеси белки внеклеточного матрикса, в культуре средств массовой информации необходима для образования инсулина, экспрессирующих колоний от Ngn3-EGFP + клеток, 2 предполагая внеклеточной матрицы важно для тех, прародителей. Использование этой колонии анализа, она теперь будет возможным дальнейшее препарировать и определить конкретные требования матрицы для такой деятельности. В дополнение к изучению прародителей производным от мышиных эмбриональных стволовых клеток, мы в настоящее время изучает ли это в пробирке анализа Система также поддерживает формирование других отличительных колоний происходит от поджелудочной железы и печени перинатальной и взрослых мышей, а также от человека трупной ткани поджелудочной железы лишенный островков.

<table border="1"><tbody><tr><td> Материал / реагент </td><td> Компания </td><td> Каталог Номер </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> 1X DMEM / F-12 (1:1) </td><td> Mediatech </td><td> 15-090-CV </td><td></td></tr><tr><td> Фетальной телячьей сыворотки </td><td> Тканевой культуры Биологические препараты </td><td> 201 </td><td> Обратитесь к разделу 1,1 </td></tr><tr><td> L-глютамин </td><td> Гибко </td><td> 25030-081 </td><td></td></tr><tr><td> 1X Дульбеко PBS </td><td> Mediatech </td><td> 21-031-CV </td><td></td></tr><tr><td> Бычьего сывороточного Альбумин </td><td> Сигма </td><td> A8412 </td><td> 7,5% </td></tr><tr><td> Матригель </td><td> Becton Дикинсон </td><td> 356231 </td><td> Уменьшение роста Фактор </td></tr><tr><td> Метилцеллюлоза </td><td> Sinetsu Химическая, Токио, Япония </td><td></td><td> 1500 сантипуаз (Высокая-VIscosity) </td></tr><tr><td> Никотинамид </td><td> Сигма </td><td> N0636 </td><td></td></tr><tr><td> Человек Рекомбинантный Активин βB </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 659-AB-025 </td><td></td></tr><tr><td> Exendin-4 </td><td> Сигма </td><td> E7144 </td><td></td></tr><tr><td> Человек Рекомбинантный VEGF- </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 293-VE-010 </td><td></td></tr><tr><td> 24-луночных планшетах </td><td> Costar </td><td> 3473 </td><td> Ультра-низкие Привязанность </td></tr><tr><td> 60 мм чашки Петри с защитной сеткой </td><td> Nunc </td><td> 169558 </td><td></td></tr></tbody></table>

a quantitative assay for insulin-expressing colony-forming progenitors

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the analysis of the single cell. Analyses of single progenitors are of critical importance because they provide definitive ways to unequivocally demonstrate the lineage potential of individual progenitors. Although methods have been devised to generate "pancreatospheres" in suspension culture from single cells, several limitations exist. First, it is time-consuming to perform single cell deposition for a large number of cells, which in turn commands large volumes of culture media and space. Second, numeration of the resulting pancreatospheres is labor-intensive, especially when the frequency of the pancreatosphere-initiating progenitors is low. Third, the pancreatosphere assay is not an efficient method to allow both the proliferation and differentiation of pancreatic progenitors in the same culture well, restricting the usefulness of the assay.
To overcome these limitations, a semi-solid media based colony assay for pancreatic progenitors has been developed and is presented in this report. This method takes advantage of an existing concept from the hematopoietic colony assay, in which methylcellulose is used to provide viscosity to the media, allowing the progenitor cells to stay in three-dimensional space as they undergo proliferation as well as differentiation. To enrich insulin-expressing colony-forming progenitors from a heterogeneous population, we utilized cells that express neurogenin (Ngn) 3, a pancreatic endocrine progenitor cell marker. Murine embryonic stem (ES) cell-derived Ngn3 expressing cells tagged with the enhanced green fluorescent protein reporter were sorted and as many as 25,000 cells per well were plated into low-attachment 24-well culture dishes. Each well contained 500 &mu;L of semi-solid media with the following major components: methylcellulose, Matrigel, nicotinamide, exendin-4, activin &beta;B, and conditioned media collected from murine ES cell-derived pancreatic-like cells. After 8 to 12 days of culture, insulin-expressing colonies with distinctive morphology were formed and could be further analyzed for pancreatic gene expression using quantitative RT-PCR and immunoflourescent staining to determine the lineage composition of each colony.
In summary, our colony assay allows easy detection and quantification of functional progenitors within a heterogeneous population of cells. In addition, the semi-solid media format allows uniform presentation of extracellular matrix components and growth factors to cells, enabling progenitors to proliferate and differentiate in vitro. This colony assay provides unique opportunities for mechanistic studies of pancreatic progenitor cells at the single cell level.

Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors at JoVE.com

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

Трехмерного клоногенных анализа, который позволяет поджелудочной подобных предшественников дифференцироваться в инсулин-выражения колонии описано. Этот метод использует полутвердых средах, содержащих метилцеллюлозу, Матригель и факторов роста, в которой один прародителей размножаться и дифференцироваться<em&gt; В пробирке</em&gt;, Что позволяет количественную оценку числа функциональных предшественников в популяции.

Количественный анализ на инсулиноподобный выражения колониеобразующих прародителей

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Количественные Phosphoproteomics в жирные кислоты Вынужденное Saccharomyces CEREVISIAE</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

Выделение и расширение добычи взрослых человеческих эндотелиальных клеток, образующих колонии Прародитель

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

Выделение и животных Сыворотка свободного расширения прав пуповины производных мезенхимальных стромальных клеток (МСК) и эндотелиальных колонии Формирование клеток-предшественников (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

Идентификация и анализ Мышь прародителей эритроидных использованием CD71/TER119 Flow-цитометрии Пробирной

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood

Фенотипическая и функциональная характеристика эндотелиальных колониеобразующих клеток, полученных из человеческой пуповинной крови

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Количественный анализ рабочих процессов Фитнес

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Анализ связывания Высокая пропускная МНС II для количественного анализа пептидных эпитопов

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Стратегия для чувствительной, крупномасштабного Количественные Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Количественный иммунофлюоресценции для измерения различий в уровне белка на центросомах

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

Развитие количественной рекомбиназу полимеразной амплификации с внутреннего положительного контроля

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...