Name: quantitation and analysis of the formation of ho-endonuclease stimulated chromosomal translocations by single-strand annealing in saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2011-09-23T15:00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae at

Dit werk werd ondersteund door middelen van de National Institutes of Health en de Beckman Research Institute van de City of Hope. We willen de reviewers bedanken voor hun constructieve commentaar die duidelijkheid toegevoegd aan het manuscript.

1. HO-gestimuleerde translocatie frequenties <ol><li> Inoculeren 10-20 onafhankelijke 1 ml culturen van YPGly / Lac medium (1% gistextract, 2% pepton, 3% glycerol en 3% lactaat) met een enkele kolonies van het gewenste genotype. Incubeer de culturen &#39;s nachts, of voor voldoende tijd om een cel dichtheid van ongeveer 5x10 1x10 7-8 cellen / ml te bereiken, bij 30 ° C op een rotator, of onder zacht schudden. </li><li> Voeg galactose aan de culturen tot een uiteindelijke concentratie van 2% tot HO-endonuclease-gericht DSB&#39;s te induceren bij de his3-Δ3 &#39;(chromosoom III) en his3-Δ5&#39; (chromosoom XV) translocatie substraten. </li><li> Incubeer gedurende 4 uur bij 30 ° C op een rotator, of onder zacht schudden. </li><li> Na 4 uur, plaat van geschikte verdunningen van de culturen op YPD (1% gistextract, 2% pepton, 2% dextrose) naar ongeveer 100 tot 200 kolonies per plaat, en een voldoende aantal cellen op medium zonder histidine geven aan een waarneembare opbrengst het aantal van Zijn + recombinant kolonies. Incubeer de platen bij 30 ° C gedurende twee tot drie dagen. </li></ol> LET OP: Stap 1.4 beschrijft de bepaling van de translocatie frequenties onder selectieve condities door uitplating de culturen op medium zonder histidine. Deze test kan ook worden uitgevoerd onder niet-selectieve omstandigheden door uitplating culturen op YPD, en vervolgens replica-plating de kolonies die zich voordoen op-Zijn platen twee tot drie dagen later. Deze methoden tot vergelijkbare frequenties van translocatie (figuur 2C). <ol start="5"><li> Bepaal de translocatie frequentie door het aantal van histidine prototrofe kolonies door het totaal aantal plated levensvatbare cellen (bepaald door uitplating verdunningen op YPD). Bepaal de mediaan translocatie frequentie en de 95%-betrouwbaarheidsinterval 15. </li></ol> 2. Plating efficiëntie <ol><li> Verwijder een aliquot van cellen van elkaar &#39;s nachts cultuur, en bepaal het aantal cellen door hemacytometer count (Baxter Healthcare Corporation Catolog #:. B3178-1). </li><li> Plaat ongeveer 100 tot 200 cellen met behulp van een geschikte verdunning op YPD. Incubeer gedurende twee tot drie dagen bij 30 ° C (bijvoorbeeld voor een cultuur met een cel dichtheid van 1x10 8 cellen / ml, moet men plaat 100-200 ul van een 10-5 verwatering per plaat). </li><li> Voeg 20% ​​galactose om de culturen tot een uiteindelijke concentratie van 2%. </li><li> Na 4 uur, verwijderen van een hoeveelheid cellen van elke cultuur, bepalen het aantal cellen door hemacytometer tellen, en de plaat ongeveer 100 tot 200 cellen met behulp van een geschikte verdunning op YPD. Incubeer gedurende twee tot drie dagen bij 30 ° C. </li><li> Bepaal de plating efficiëntie door het aantal kolonies die op YPD door het aantal cellen geplateerd, en vermenigvuldigen dit quotiënt met 100. Bepaal de mediaan percentage met een betrouwbaarheidsinterval van 95%. </li></ol> 3. Genomische Southern blot-analyse <ol><li> Selecteer een Zijn + recombinant kolonie van elke onafhankelijke studie en voor te bereiden genomisch DNA 16. </li><li> Digest ongeveer 4 ug van DNA met BamHI restrictie-endonuclease. </li><li> Aparte BamHI verkregen fragmenten op een 0,7% agarose gel, en over te dragen aan een positief geladen nylon membraan (Hybond N +, GE Healthcare Product Code:. RPN303B) 17. </li><li> Hybridiseren met een 32 P-gelabelde probe verkregen door een willekeurige priming (Amersham Biosciences Product Code:. RPN1604) met een 1,8 kb BamHI / BamHI genomische kloon die het HIS3 gen. </li><li> Visualiseer DNA-fragmenten door autoradiografie of phosphorimaging. </li></ol> 4. Chromosoom blot analyse met behulp van chromosomen gescheiden in een contour-geklemde homogeen elektrisch veld (CHEF): <ol><li> Bereid chromosomen van geselecteerde Zijn + recombinanten in agarose pluggen 18: <ul><li> Grow een vloeibare cultuur van het Zijn + kandidaat TXV:: III chromosoom-bevattende recombinant in 5 ml YPD tot ongeveer 1-2 x 10 8 cell / ml. </li><li> Spin down en was de cellen twee keer met 50 mM EDTA. </li><li> Resuspendeer cellen in ongeveer 200 ul van 50 mM EDTA, en warm tot 50 ° C. </li><li> Voeg een gelijk volume van gesmolten 2% (w / v) low melt agarose gebracht tot 50 ° C, meng zorgvuldig. </li><li> Verdeel ongeveer 80 ul fracties in de stekker mallen, en laat ze gedurende 30 minuten afkoelen bij 4 ° C. </li><li> Extrude stekkers uit de mal in een 12-well schotel. Tot vijf pluggen kunnen worden geplaatst in elk putje. </li><li> Voeg 3 ml vers bereide spheroplasting oplossing (14 mM 2-β-mercapto-ethanol, 20 mM EDTA, 0,5 mg / ml Zymolyase 20T, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 M sorbitol) aan elk putje. Incubeer bij 37 ° C gedurende 4 uur onder zacht schudden. </li><li> Verwijder spheroplasting oplossing en te vervangen door 3 ml van LDS-oplossing (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM EDTA, 1% (w / v) Lithium dodecylsulfaat, verstelbaart pH tot 8,0). Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten onder zacht schudden. </li><li> Verwijder de LDS oplossing en vervangen door een andere 3 ml van LDS. Incubeer bij 37 ° C gedurende de nacht onder zacht schudden. </li><li> Verwijder de LDS en te vervangen door 3 ml van 0,2 X NDS (0,6 g Tris Base, 93 g dinatrium EDTA Dihydraat, 5 g N-Lauroyl sarcosine, breng de pH op 8,0, gebracht tot 500 ml met dH 2 O). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten onder zacht schudden. Verwijder de NDS, en herhaal twee keer. </li><li> Verwijder de NDS en te vervangen door 3 ml TE. Wassen met zacht schudden gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal dit 4 keer. </li><li> Bewaar stekkers bij 4 ° C in 2 ml van TE. Pluggen kunnen houden tot een jaar. </li></ul></li><li> Aparte chromosomen op een 1% agarosegel met behulp van een Bio-Rad CHEF-DRII apparaat bij 14 ° C (Catalog #: 170 tot 3.612). </li></ol> Parameters: 1 ste Blok: 70s tijd instellen, 15u op 6V/cm. 2 e Vak: 120s tijd instellen, 11u op 6V/cm <ol start="3"><li> Visualiseer chromosomen door kleuring met ethidiumbromide 1μg/ml gedurende 30 min, bestraling met 60 mJ van UV in een UV-Stratalinker (Stratagene), en de-kleuring voor 30 min in dH 2 O. Bestralen ethidiumbromide gekleurde chromosomen inkepingen van de DNA te zorgen voor efficiënte overdracht aan het membraan. </li><li> Overdracht chromosomen van een positief geladen membraan (Hybond N +, GE Healthcare Product Code:. RPN303B) door capillaire werking in denaturerende omstandigheden (0.4N NaOH, 1.5M NaCl). </li><li> Hybridiseren met een 32 P-gelabelde probe verkregen door een willekeurige priming (Amersham Biosciences Product Code:. RPN1604) met een 1,8 kb BamHI / BamHI genomische kloon die het HIS3-gen 17. </li><li> Visualiseer chromosomen door autoradiografie of phosphorimaging. </li></ol> 5. Representatieve resultaten: Een grafische weergave van de translocatie test is afgebeeld op het chromosomaal niveau (figuur 1). Een schema van de experimentele procedure wordt ook weergegeven (Figuur 2A). Zowel de pre-en post-inductie plating rendementen worden bepaald door het totaal aantal levensvatbare, kolonievormende cellen door het totaal aantal cellichamen in de cultuur wordt bepaald door hemacytometer count (Figuur 4B). Pre-en post-inductie plating efficiënties waren niet significant verschillend voor wild-type cellen (p-waarde = 0,1400) (Tabel 1). <img src="/files/ftp_upload/3150/3150table1.jpg" alt="Tabel 1" /> Tabel 1. Pre-en post-inductie plating efficiëntie in wild-type cellen. een Het aantal cellichamen per milliliter worden bepaald door hemacytometer tellen. b Het aantal levensvatbare cellen per milliliter worden bepaald door plating van geschikte verdunningen op niet-selectief medium tot ~ 100 tot 200 kolonies te produceren. c De pre-en post-inductie plating rendementen worden bepaald door het totaal aantal levensvatbare, kolonievormende, cellen door het totaal aantal cellichamen in de cultuur, bepaald door hemacytometer tellen. Dit suggereert dat de aanwezigheid of afwezigheid van een van beide translocatie chromosoom geen invloed heeft op het vermogen om te DSB formatie te overleven. De frequentie van chromosomale translocaties kan worden berekend door het aantal histidine prototrofe kolonies door het totaal aantal levensvatbare cellen bepaald door uitplating op YPD (Figuur 2B). Deze test kan worden uitgevoerd met behulp van verschillende stammen van genotype te bepalen hoe het verlies van eiwit functie van invloed op SSA (rad51Δ ie - / -). Recombinatie-frequenties bepaald in verschillende stammen kan dan worden getekend om de verschillen in het vermogen van deze stammen voor de HO-endonuclease veroorzaakt DSB&#39;s te repareren door SSA (figuur 2C) te vergelijken. Translocatie frequenties verkregen met het wild-type diploïde stam onder selectieve (2.2x10 -2) en niet-selectieve (2.17x10 -2) omstandigheden waren niet statistisch significant verschillend van elkaar (p-waarde = 0,9131), terwijl de translocatie frequenties verkregen selectief (6.0x10 -2) en niet-selectief (11.9x10 -2) met de rad51Δ - / - homozygoot waren gelijk, maar statistisch verschillend (p-waarde = 0,0089). De frequenties die verkregen zijn zowel selectief (p-waarde = 0,0001) en niet-selectief (p-waarde = 0,0002) met de RAD51 ° - / - homozygoot waren statistisch significant verschillend van verkregen die gebruik maken van de daarbij gestelde voorwaarden met het wild-type stam. Vermoedelijke translocatie-dragende klonen kunnen verder worden onderzocht door genomische Southern blot en chromosomale blot analyses (figuur 3). Voor Zuid-analyse wordt genomisch DNA geknipt met BamHI endonuclease voorafgaand aan de agarosegel elektroforese, blotting en hybridisatie met een 32P-gelabelde 1.8kb HIS3 sonde naar de diagnostische 0,8 kb his3Δ200, 1,7 kb his3-Δ3 &#39;, 4 kb tIII:: XV, 5 kb TXV:: III, en 8 kb his3-Δ5&#39; visualiseren fragmenten (figuur 3B.1) . Intact chromosomen kunnen worden bereid, gescheiden door chef-kok (figuur 3B.2), uitgewist met nylon en gehybridiseerd met de 32 P-gelabelde 1,8 kb HIS3 sonde naar 1,1 Mb intact chromosoom XV, 0,8 Mb TXV visualiseren: III translocatie chromosoom, 0,6 Mb tIII: XV translocatie chromosoom, en 0,3 Mb intact chromosoom III (figuur 3B.3). Een grafische kaart afgebeeld verwacht BamHI endonuclease-verteerd genomische DNA-fragmenten, en ouder en recombinant chromosomen, is afgebeeld (Figuur 3A). <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. De vorming van translocatie chromosomen door de single-streng gloeien (SSA). 1) DSB&#39;s zijn gemaakt op de his3-Δ3 &#39;en his3-Δ5&#39; substraten (chromosomen XV en III, respectievelijk) door HO endonuclease na toevoeging van galactose aan de culturen. 2) DSB&#39;s zijn verwerkt tot drie &#39;single-strengen te genereren aan de uiteinden van de chromosomen. 3) SSA machines anneals complementaire 311 of 60 nucleotide enkelstrengs HIS3 sequenties gevormd bij elk van de recombinatie substraten. Niet-homologe staarten gevormd na uitgloeien worden verwijderd door endonuclease spijsvertering. Aanvullende vier bp overhangen op de resterende chromosomale fragmenten gevormd door HO-endonuclease spijsvertering kan ook gloeien. 4) Ligatie sluit de oprichting van een intacte HIS3-gen en TXV:: III translocatie chromosoom door SSA. Cellen die dit chromosoom kan worden geselecteerd door hun vermogen om te groeien op medium zonder histidine. Ligatie kan ook leiden tot de wederzijdse tIII:: XV translocatie chromosoom door een NHEJ-achtige mechanisme. <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. Test voor het bepalen van de frequentie van de translocatie van SSA. A) Een ml YPGly / Lac culturen worden geënt met enkele kolonies van cellen van een select genotype en uitgegroeid tot een geschikte dichtheid van ongeveer 5x10 1x10 7-8 cellen / ml. Galactose wordt toegevoegd tot een uiteindelijke concentratie van 2% tot DSB&#39;s te creëren op de recombinatie substraten op chromosomen III en XV. Voor het uitvoeren van de test onder selectieve condities, geschikt zijn verdunningen gemaakt zodanig dat ongeveer 100 tot 200 cellen worden uitgeplaat op YPD en een voldoende aantal cellen worden uitgeplaat op medium zonder histidine om een waarneembare aantal van Zijn + recombinant kolonies opleveren. Voor het uitvoeren van de test zonder selectie, zijn ongeveer 100 tot 200 cellen uitgeplaat op YPD, geteeld voor twee tot drie dagen aan enkele kolonies en vervolgens replica uitgeplaat op medium zonder histidine. B) translocatie frequentie kan worden bepaald door het aantal kolonies dat on-Zijn platen groeien door de fractie die groeien op YPD. C) De translocatie frequenties van de verschillende stammen van genotype (dat wil zeggen wild-type en rad51Δ - / -) kan worden getekend om de verschillen in het vermogen van deze stammen aan de DSB&#39;s te repareren door SSA vergelijken. <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig3.jpg" alt="Figuur 3" /> Figuur 3. Het bepalen van plating efficiëntie. (A) Een deel van de cellen is ontleend aan de &#39;s nachts cultuur voorafgaand aan en na de DSB inductie, geschikt zijn verdunningen gemaakt, gevolgd door een hemacytometer tellen tot het totaal aantal cellichamen per ml van de cultuur te bepalen. Van geschikte verdunningen zijn uitgeplaat op niet-selectief medium om het totale aantal levensvatbare cellen per ml te bepalen, door het tellen van de kolonies die op YPD. (B) De beplating rendement wordt dan bepaald door het totaal aantal levensvatbare cellen door het totaal aantal van de cellichamen, en vermenigvuldigen dit quotiënt met 100. <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig4.jpg" alt="Figuur 4" /> Figuur 4. Detectie van chromosomale translocatie evenementen door genomische Southern blot en chromosoom blot analyses. A) Grafische weergave van relevante chromosomen voor (links) en na (rechts) translocatie formatie. Afmetingen van ouder en recombinant chromosomen worden in megabase-paren (Mb). Maten van restrictiefragmenten met relevante sequenties gegenereerd door BamHI digestie van genomisch DNA van ouder-en recombinante stammen, en onthulde op de blots door hybridisatie met een 1,8 kb BamHI HIS3 genomische kloon, zijn weergegeven in kilobase-paren (kb). Chromosomen zijn niet op schaal getekend. B) Fysische analyse van de vermeende translocatie-dragende klonen. (1) Genomic Southern-blot-analyse - Genomic DNA werd verzameld en gedigereerd met BamHI restrictie-endonuclease, gefractioneerd door gelelektroforese, bloTTED tot nylon, en gehybridiseerd met een 32 P-gelabelde 1,8 kb HIS3 sonde naar de volgende fragmenten te visualiseren: 0,8 kb his3Δ200, 1,7 kb his3-Δ3 &#39;, 4 kb tIII:: XV, 5 kb TXV:: III, en 8 kb his3-Δ5 &#39;. Lanes: een) ouder diploïde, b) Zijn + niet-wederzijdse translocatie recombinant, c) Zijn + wederzijdse translocatie recombinant. (2) CHEF gels - Intact chromosomen werden voorbereid in agarose pluggen, gescheiden door chef-kok, gekleurd met ethidiumbromide en zichtbaar onder UV-licht. Lanes: Zoals hierboven. (3) Chromosoom blots - Gescheiden chromosomen uitgewist om nylon en gehybridiseerd met de 32 P-gelabelde 1,8 kb HIS3 sonde naar de volgende chromosomen te visualiseren: 1.1 Mb intact chromosoom XV, 0,8 Mb TXV: III translocatie chromosoom, 0,6 Mb tIII: XV translocatie chromosoom, en 0,3 Mb intact chromosoom III. Lanes: Zoals hierboven.

<ol>
	<li>Sen, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+genomic+deletions+mediated+by+recombination+between+Alu+elements.">Human genomic deletions mediated by recombination between Alu elements.</a> The American Journal of Human Genetics. 79, 41-53 (2006).</li><li>Han, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alu+recombination-mediated+structural+deletions+in+the+chimpanzee+genome.">Alu recombination-mediated structural deletions in the chimpanzee genome.</a> Plos Genetics. 3, 1939-1949 (2007).</li><li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copy+number+variation+in+human+health,+disease,+and+evolution.">Copy number variation in human health, disease, and evolution.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 10, 451-481 (2009).</li><li>Goodier, J. L., Kazazian, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrotransposons+revisited:+The+restraint+and+rehabilitation+of+parasites.">Retrotransposons revisited: The restraint and rehabilitation of parasites.</a> Cell. 135, 23-35 (2008).</li><li>Lanktree, M., Hegele, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copy+number+variation+in+metabolic+phenotypes.">Copy number variation in metabolic phenotypes.</a> Cytogenet Genome Res. 123, 169-175 (2008).</li><li>Mullighan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+genetic+alterations+in+acute+lymphoblastic+leukaemia.">Genome-wide analysis of genetic alterations in acute lymphoblastic leukaemia.</a> Nature. 446, 758-764 (2007).</li><li>Mattarucchi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microhomologies+and+interspersed+repeat+elements+at+genomic+breakpoints+in+chronic+myeloid+leukemia.">Microhomologies and interspersed repeat elements at genomic breakpoints in chronic myeloid leukemia.</a> Genes Chromosomes Cancer. 47, 625-632 (2008).</li><li>Stenger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biased+distribution+of+inverted+and+direct+Alus+in+the+human+genome:+implications+for+insertion,+exclusion,+and+genome+stability.">Biased distribution of inverted and direct Alus in the human genome: implications for insertion, exclusion, and genome stability.</a> Genome Res. 11, 12-27 (2001).</li><li>Hedges, D., Deininger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inviting+instability:+Transposable+elements,+double-strand+breaks,+and+the+maintenance+of+genome+integrity.">Inviting instability: Transposable elements, double-strand breaks, and the maintenance of genome integrity.</a> Mutat Res. 616, 46-59 (2007).</li><li>Symington, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+RAD52+epistasis+group+genes+in+homologous+recombination+and+double-strand+break+repair.">Role of RAD52 epistasis group genes in homologous recombination and double-strand break repair.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 66, 630-670 (2002).</li><li>Lewis, L., Resnick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tying+up+loose+ends:+nonhomologous+end-joining+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Tying up loose ends: nonhomologous end-joining in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mutat Res. 451, 71-89 (2000).</li><li>Pannunzio, N. R., Manthey, G. M., Bailis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAD59+is+required+for+efficient+repair+of+simultaneous+double-strand+breaks+resulting+in+translocations+in+Saccharomyces+cerevisiae.">RAD59 is required for efficient repair of simultaneous double-strand breaks resulting in translocations in Saccharomyces cerevisiae.</a> DNA Repair (Amst). 7, 788-800 (2008).</li><li>Nicholas, R., Pannunzio, G. M. M., Bailis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAD59+and+RAD1+cooperate+in+translocation+formation+by+single-strand+annealing+in+Saccharomyces+cerevisiae.">RAD59 and RAD1 cooperate in translocation formation by single-strand annealing in Saccharomyces cerevisiae.</a> Curr Genet. 56, 87-100 (2010).</li><li>Manthey, G. M., Bailis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad51+Inhibits+Translocation+Formation+by+Non-Conservative+Homologous+Recombination+in+Saccharyomyces+cerevisiae.">Rad51 Inhibits Translocation Formation by Non-Conservative Homologous Recombination in Saccharyomyces cerevisiae.</a> Plos One. 5, (2010).</li><li>Hoffman, C. S., Winston, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ten-minute+DNA+preparation+from+yeast+efficiently+releases+autonomous+plasmids+for+transformation+of+Escherichia+coli.">A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli.</a> Gene. 57, 267-272 (1987).</li><li>Sambrook, J., MacCallum, P., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2001).</li><li>Iadonato, S. P., Gnirke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RARE-cleavage+analysis+of+YACs.">RARE-cleavage analysis of YACs.</a> Methods Mol. Biol. , 75-85 (1999).</li><li>Argueso, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand+breaks+associated+with+repetitive+DNA+can+reshape+the+genome.">Double-strand breaks associated with repetitive DNA can reshape the genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 11845-11850 (2008).</li><li>Batzer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alu+repeats+and+human+disease.">Alu repeats and human disease.</a> Molecular Genetic Metabolism. 67, 183-193 (1999).</li><li>Fasullo, M., Dave, P., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-damaging+agents+stimulate+the+formation+of+directed+reciprocal+translocations+in+Saccharomyces+cerevisiae.">DNA-damaging agents stimulate the formation of directed reciprocal translocations in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mutat. Res. 314, 121-133 (1994).</li><li>Richardson, C., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+chromosomal+translocations+induced+by+DNA+double-strand+breaks.">Frequent chromosomal translocations induced by DNA double-strand breaks.</a> Nature. 405, 697-700 (2000).</li><li>Look, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+altered+by+chromosomal+translocations+in+leukemias+and+lymphomas.">Genes altered by chromosomal translocations in leukemias and lymphomas.</a> The Genetic Basis of Human Cancer. , (2002).</li><li>Fasullo, M. T., Davis, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direction+of+chromosome+rearrangements+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+use+of+his3+recombinational+substrates.">Direction of chromosome rearrangements in Saccharomyces cerevisiae by use of his3 recombinational substrates.</a> Mol. Cell. Biol. 8, 4370-4380 (1988).</li><li>Manthey, G. M., Naik, N., Bailis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Msh2+Blocks+an+Alternative+Mechanism+for+Non-Homologous+Tail+Removal+during+Single-Strand+Annealing+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Msh2 Blocks an Alternative Mechanism for Non-Homologous Tail Removal during Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae.</a> PLoS One. 4, e7488-e7488 (2009).</li><li>Muller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-course+of+radiation-induced+chromosomal+aberrations+in+tumor+patients+after+radiotherapy.">Time-course of radiation-induced chromosomal aberrations in tumor patients after radiotherapy.</a> Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 63, 1214-1220 (2005).</li><li>Lin, F. L., Sperle, K., Sternberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+for+homologous+recombination+during+transfer+of+DNA+into+mouse+L+cells:+role+of+DNA+ends+in+the+recombination+process.">Model for homologous recombination during transfer of DNA into mouse L cells: role of DNA ends in the recombination process.</a> Mol. Cell. Biol. 4, 1020-1034 (1984).</li><li>Ivanov, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Requirements+for+the+single-strand+annealing+pathway+of+double-strand+break+repair+in+Saccharyomyces+cerevisiae.">Genetic Requirements for the single-strand annealing pathway of double-strand break repair in Saccharyomyces cerevisiae.</a> Genetics. 142, 693-704 (1996).</li></ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Hoge doses ioniserende straling aanwezig is een inherent risico van het genoom instabiliteit door het genereren van een groot aantal van de DSB&#39;s 19. Eukaryote genomen worden vol met repeterende sequenties die zijn uitstekend substraten voor het genereren van translocaties en andere genomische herschikkingen 20,21. Chromosomale translocaties door HR worden vaak waargenomen als DSB&#39;s worden ingevoerd tussen repetitieve sequenties 12,21,22. Overweldigend bewijs suggereert dat veel van de genomische instabiliteit geassocieerd met leukemie en lymfomen kan worden toegeschreven aan chromosomale translocaties, met de nadruk op het belang te begrijpen hoe dit mechanisme komt voor in eukaryoten 22,23. We hebben een systeem ontwikkeld in gist voor de behandeling van de vorming van translocatie chromosomen door de DSB-geïnduceerde HR tussen de korte regio&#39;s van homologie op verschillende chromosomen die vergelijkbaar zijn in grootte met repetitieve elementen verspreid over de gist en het menselijk genoom. In de test, is de his3-Δ3 &#39;translocatie substraat bevindt zich op een exemplaar van chromosoom XV. De andere his3 allel (his3-Δ200) heeft een ~ 1kb deletie van het HIS3 promotor en coderende sequentie dat deze volgorde niet kunnen worden gebruikt als een sjabloon voor reparatie 24. De his3-Δ5 &#39;substraat is gelegen aan de LEU2 locus op een exemplaar van chromosoom III, met de andere kopie van chromosoom III met een ongewijzigd LEU2 allel (figuur 1). Een galactose-induceerbare HO endonuclease expressiecassette gemarkeerd met KAN-MX werd ingebracht in de TRP1 locus van chromosoom IV (trp1:: GAL-HO-KAN-MX). Elke translocatie substraat wordt geflankeerd door een HO-endonuclease herkenningssequentie dat kan voor splitsing worden gericht door het induceren van de expressie van de HO-gen door de toevoeging van galactose aan het medium. Na de HO-endonuclease geïnduceerde decollete op de his3-Δ3 &#39;en his3-Δ5 &quot;substraten, kunnen cellen efficiënt gebruik te maken van de gedeelde korte darmkanaal van HIS3 sequentiehomologie (311 bp of 60 bp) om het gebroken chromosomen reparatie door P &amp; O, het genereren van een translocatie chromosoom met een intact HIS3 allel 12-14,25. Omdat de ouder cellen missen een intacte kopie van het HIS3 gen, ze zijn niet in staat om te groeien op zijn medium. Alleen cellen die werden onderworpen aan de translocatie evenement kan worden geselecteerd voor op medium zonder histidine. Daarom kan de frequentie van chromosomale translocaties wordt berekend door het aantal histidine prototrofe kolonies door het totaal aantal levensvatbare cellen geplateerd, bepaald door uitplating op YPD. Genomisch DNA en chromosomen intact kunnen dan worden geïsoleerd uit representatief Zijn + kolonies, en de aanwezigheid van een translocatie chromosoom geverifieerd door genomische Zuid-en chromosoom blot analyses. Een zorgvuldige analyse heeft ons toegestaan ​​om meer belangrijke informatie over de test 12 te verzamelen. Genomische Southern blot-analyse heeft aangetoond dat er sprake is vrijwel volledig te snijden van chromosomen XV en III na 30 minuten van de HO-endonuclease inductie, en er is dus geen significante achtergrond van onversneden chromosomale substraten in de bevolking (G. Manthey &amp; A. Bailis, niet-gepubliceerde resultaten). Genomische Zuid-en chromosoom blot analyses van Zijn - overlevenden geeft aan dat cellen vaak een, de andere, of beide gesneden chromosomen verliezen en levensvatbaar te blijven (L. Liddell &amp; A. Bailis, ongepubliceerde resultaten). Belangrijk is dat het nagenoeg gelijk plating efficiëntie op niet-selectief medium voor en na de inductie van expressie van HO-endonuclease geeft aan dat noch het niet gebroken chromosomen te herstellen, noch het feit dat translocatie chromosomen behouden de mogelijkheid om DSB formatie te overleven beïnvloedt. In overeenstemming met deze, de TXV: III translocatie chromosoom is aangetoond dat het onstabiel in mitotische cellen in de afwezigheid van selectie. Dit werd aangetoond door de groeiende TXV:: III met zijn + recombinanten &#39;s nachts niet-selectief, plating enkele kolonies op niet-selectieve platen, en replica plating op selectief medium zonder histidine. Tien tot 70% van de kolonies die op deze platen hadden verloren van de TXV:: III translocatie chromosoom (N. Pannunzio &amp; A. Bailis, ongepubliceerde resultaten). Translocatie chromosomen gegenereerd door IR-blootstelling bij de mens vertonen een vergelijkbaar instabiliteit 26. Dit suggereert dat de translocatie vorming van mei tot begin gebeurtenissen in tumorigenese een bijdrage leveren door het bevorderen van het verlies van heterozygotie. Ten tweede, uitgebreide genetische en moleculaire analyses suggereren dat SSA, een efficiënte en verplicht niet-conservatieve mechanisme van HR, is het belangrijkste mechanisme van de translocatie vorming door P &amp; O na het gelijktijdig creëren van DSB op twee chromosomen 12,27,28. Dit is medensistent met de bevinding dat grote doses van IR resulteert in een dichtheid van DSB voldoende pauzes grenzend aan meerdere repetitieve sequenties in het genoom van gist te creëren, en een hoge frequentie van de translocatie vorming door HR. Samen vormen deze waarnemingen suggereren dat de oncogene effect van de IR-blootstelling bij de mens kan in een deel, het gevolg zijn van de reparatie van DSB door een efficiënt mechanisme van de HR dat genereert translocaties die door hun inherente instabiliteit, te bevorderen genetische veranderingen die de lancering ontstaan ​​van tumoren. Omdat de straling wordt vaak gebruikt om kanker, genoom herschikkingen te behandelen die voortvloeien uit reparatie van straling geïnduceerde DSB&#39;s kunnen bijdragen aan het genereren van secundaire kankers die vaak ontstaan ​​bij patiënten. Zo kan dit model ons helpen een beter inzicht in de genetische en moleculaire basis van een belangrijke klinische respons op IR-behandeling.

quantitation and analysis of the formation of ho-endonuclease stimulated chromosomal translocations by single-strand annealing in saccharomyces cerevisiae

Genetische variatie wordt vaak bemiddeld door genomische herschikkingen die ontstaan ​​door interactie tussen verspreide repetitieve elementen aanwezig zijn in elke eukaryote genoom. Dit proces is een belangrijk mechanisme voor het genereren van diversiteit tussen en binnen organismen 1-3. Het menselijk genoom bestaat uit ongeveer 40% repetitieve opeenvolging van retrotransposon oorsprong, zoals een verscheidenheid aan lijnen en SINES 4. Exchange gebeurtenissen tussen deze repetitieve elementen kan leiden tot herschikkingen genoom, met inbegrip van translocaties, dat gen dosering en de uitdrukking die kan leiden tot auto-immuunziekten en hart-en vaatziekten 5, evenals kanker bij de mens 6-9 kunnen verstoren. Uitwisseling tussen repetitieve elementen gebeurt in een verscheidenheid van manieren. Uitwisseling tussen sequenties die perfect (of bijna-perfecte) homologie delen gebeurt door een proces genaamd homologe recombinatie (HR). Daarentegen, niet-homologe eind mee (NHEJ) maakt gebruik van weinig-of-geen sequentiehomologie voor uitwisseling 10,11. Het primaire doel van HR, in mitotische cellen, is te repareren dubbel-breuken (DSB&#39;s) gegenereerd door endogeen afwijkende DNA-replicatie en oxidatieve laesies, of door blootstelling aan ioniserende straling (IR), en andere exogene DNA-beschadigende agenten. In de assay hier beschreven, zijn DSB&#39;s tegelijk gemaakt grenzend recombinatie substraten op twee verschillende chromosomale loci in diploïde cellen door een galactose-induceerbare HO-endonuclease (figuur 1). De reparatie van de gebroken chromosomen genereert chromosomale translocaties door enkele streng gloeien (SSA), is een proces waarbij homologe sequenties grenzend aan het chromosoom uiteinden covalent verbonden na gloeien. Een van de substraten, his3-Δ3 &#39;, bevat een 3&#39; afgeknot HIS3 allel en bevindt zich op een kopie van chromosoom XV bij de inheemse HIS3 locus. Het tweede substraat, his3-Δ5 &#39;, is gelegen aan de LEU2 locus op een exemplaar van chromosoom III, en bevat een 5 &quot;afgeknotte HIS3 allel. Beide substraten worden geflankeerd door een HO endonuclease herkenningsplaats dat kan voor incisie worden gericht op HO-endonuclease. HO endonuclease herkenningsplaatsen inheems in het MAT locus, op beide kopieën van chromosoom III, zijn verwijderd in alle stammen. Dit voorkomt dat de interactie tussen de recombinatie substraten en andere gebroken chromosoom einden van inmenging in de test. Het KAN-MX-gemarkeerde galactose-induceerbare HO endonuclease expressiecassette wordt toegevoegd aan het TRP1 locus op chromosoom IV. De substraten aandeel van 311 bp of 60 bp van de HIS3 coderende sequentie die kan door de HR-machines voor reparatie worden gebruikt door SSA. Cellen die deze substraten te gebruiken om gebroken chromosomen te herstellen door HR vormen een intact HIS3 allel en een TXV:: III chromosomale translocatie dat kan voor worden gekozen door het vermogen om te groeien op medium zonder histidine (Figuur 2A). Translocatie frequentie van HR wordt berekend door het aantal histidine prototrofe kolonies die op selectief medium ontstaan ​​door het totale aantal levensvatbare cellen die zich voordoen na plateren van geschikte verdunningen op niet-selectieve medium (Figuur 2B). Een verscheidenheid van DNA-herstel mutanten zijn gebruikt om de genetische controle van de translocatie vorming studie door SSA behulp van dit systeem 12-14.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae at 

Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae

De HO-gestimuleerde translocatie assay monitoren enkelstrengs gloeien na de oprichting van DNA dubbelstrengs breuken op meerdere loci in diploïde<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Dit mechanisme kan model genoom herschikkingen in somatische cellen van hogere eukaryoten na blootstelling aan hoge doses ioniserende straling.

Kwantificering en analyse van de vorming van HO-endonuclease chromosomale translocaties Gestimuleerd door Single-Strand Gloeien in Saccharomyces cerevisiae</em

Genetic variation is frequently mediated by genomic rearrangements that arise through interaction between dispersed repetitive elements present in every ...

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Dissectie van Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Kwantitatieve Phosphoproteomics in Fatty Acid Gestimuleerd Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Tissue Samples

Kwantificatie van γH2AX Foci in weefselmonsters

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray analyse voor Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Een fluorescentie microscopie Assay voor de bewaking Mitophagy in de Gist Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expressie en zuivering van de Cystic Fibrosis transmembrane conductance regulator Eiwit in Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisatie en analyse van mRNA moleculen met behulp van fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Gekoppeld Testen voor Monitoring Protein Refolding in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Zuivering van het Cystic Fibrosis transmembrane conductance regulator eiwit dat tot expressie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

EPR Bewaakte redoxtitratie van de Cofactoren van<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...