Name: quantitation and analysis of the formation of ho-endonuclease stimulated chromosomal translocations by single-strand annealing in saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2011-09-23T15:00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae at

Detta arbete stöddes av medel från National Institutes of Health och Beckman forskningsinstitut City of Hope. Vi vill tacka granskarna för deras konstruktiva kommentarer som läggs klarhet till manuskriptet.

1. HO-stimulerad translokation frekvenser <ol><li> Inokulera 10-20 oberoende 1 ml kulturer YPGly / Lac medelhög (1% jästextrakt, 2% pepton, 3% glycerol och 3% laktat) med enstaka kolonier av önskad genotyp. Inkubera kulturer över natten, eller i tillräckligt lång tid för att nå en cell täthet av ca 5x10 7-1x10 8 celler / ml vid 30 ° C på en rotator, eller under försiktig omrörning. </li><li> Lägg galaktos till kulturerna till en slutlig koncentration på 2% för att förmå HO endonuclease-riktat DSBs på his3-Δ3 &quot;(kromosom III) och his3-Δ5&quot; (kromosom XV) translokation substrat. </li><li> Inkubera i 4 h vid 30 ° C på en rotator, eller under försiktig omrörning. </li><li> Efter 4 h, tallrik lämpliga utspädningar av kulturer på YPD (1% jästextrakt, 2% pepton, 2% glukos) för att erhålla cirka 100 till 200 kolonier per platta och ett tillräckligt antal celler på medelhög saknas histidin ge en märkbar Antalet Hans + rekombinant kolonier. Inkubera plattorna vid 30 ° C i två till tre dagar. </li></ol> OBS: Steg 1,4 beskriver bestämning av translokation frekvenser vid selektiv förhållanden genom bordläggning de kulturer på mediet saknas histidin. Denna analys kan också göras under icke-selektiva villkor genom bordläggning kulturer på YPD och sedan replika-plating kolonierna som uppstår på-hans plattor två till tre dagar senare. Dessa metoder ger liknande frekvenser av translokation (figur 2C). <ol start="5"><li> Bestäm translokation frekvens genom att dividera antalet kolonier histidin prototrophic med det totala antalet livskraftiga pläterade celler (bestäms av bordläggning spädningar på YPD). Bestäm medianen translokation frekvens och 95% konfidensintervall 15. </li></ol> 2. Plating effektivitet <ol><li> Ta bort en alikvot av celler från varje natt kultur, och bestämma mobilnummer genom hemacytometer räknare (Baxter Healthcare Corporation Catolog #:. B3178-1). </li><li> Plate ungefär 100 till 200 celler med en lämplig utspädning till YPD. Inkubera i två till tre dagar vid 30 ° C (t.ex. för en kultur med en celltäthet av 1x10 8 celler / ml, en bör tallrik 100-200 ìl av en 10-5 utspädning per platta). </li><li> Lägg till 20% galaktos till kulturerna till en slutlig koncentration på 2%. </li><li> Efter 4 timmar, ta bort en delmängd av celler från varje kultur, bestäm cell antalet med hemacytometer räkna och plåt cirka 100 till 200 celler med en lämplig utspädning till YPD. Inkubera i två till tre dagar vid 30 ° C. </li><li> Bestäm plätering effektivitet genom att dividera antalet kolonier förekommer på YPD med antalet celler pläterade, och multiplicera kvoten med 100. Bestäm median-andelen med 95% konfidensintervall. </li></ol> 3. Genomic Southern blot-analys <ol><li> Markera en enskild Hans + rekombinant koloni från varje oberoende försök och förbereda genomiska DNA 16. </li><li> Digest cirka 4 mikrogram av DNA med BamHI begränsning endonuclease. </li><li> Separat BamHI smält fragment på en 0,7% agarosgel, och överför till en positivt laddad nylon membran (Hybond N +, GE Healthcare Produktkod:. RPN303B) 17. </li><li> Hybridisera med 32 P-märkt probe erhålls genom slumpmässiga priming (Amersham Biosciences Produktkod:. RPN1604) med en 1,8 kb BamHI / BamHI genomisk klon som innehåller HIS3 genen. </li><li> Visualisera DNA-fragment av autoradiografi eller phosphorimaging. </li></ol> 4. Kromosom blot analys med kromosomerna separeras i en kontur-fastklämd homogent elektriskt fält (Chef): <ol><li> Förbered kromosomer från utvalda Hans + rekombinanter i agaros pluggar 18: <ul><li> Odla en flytande kultur Hans + kandidat tXV:: III kromosom innehåller rekombinant i 5 ml YPD till ca 1-2 x 10 8 celler / ml. </li><li> Spinn ner och tvätta cellerna två gånger med 50 mM EDTA. </li><li> Resuspendera cellerna i cirka 200 l av 50 mM EDTA, och värm till 50 ° C. </li><li> Tillsätt en motsvarande volym av smält 2% (w / v) låg smälta agaros förde till 50 ° C, blanda omsorgsfullt. </li><li> Fördela cirka 80 l alikvoter i kontakt formar, och låt dem svalna i 30 minuter vid 4 ° C. </li><li> Extrude pluggar ur formen till en 12-bra maträtt. Upp till fem pluggar kan placeras i varje brunn. </li><li> Tillsätt 3 ml nyberedd spheroplasting lösning (14 mm 2-β-merkaptoetanol, 20 mM EDTA, 0,5 mg / ml Zymolyase 20T, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 m sorbitol) i varje brunn. Inkubera vid 37 ° C i 4 timmar under försiktig omrörning. </li><li> Ta bort spheroplasting lösning och ersätta med 3 ml LDS-lösning (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM EDTA, 1% (w / v) Litium Dodecyl Sulfate, adjust pH till 8,0). Inkubera vid 37 ° C i 15 minuter under försiktig omrörning. </li><li> Ta bort LDS lösning och ersätt med ytterligare 3 ml alikvot av LDS. Inkubera vid 37 ° C över natten under försiktig omrörning. </li><li> Ta bort LDS och ersätt med 3 ml 0,2 x NDS (0,6 g Tris Base, 93 g Disodium EDTA Dihydrat, 5 g N-Lauroyl sarkosin, justera pH till 8,0, förde till 500 ml med dH 2 O). Inkubera vid rumstemperatur i 30 minuter under försiktig omrörning. Ta bort NDS, och upprepa två gånger. </li><li> Ta bort NDS och ersätt med 3 ml TE. Tvätta med försiktig omrörning i 30 minuter vid rumstemperatur. Upprepa 4 gånger. </li><li> Förvara pluggar vid 4 ° C i 2 ml TE. Pluggar kan hålla i upp till ett år. </li></ul></li><li> Separat kromosomerna på en 1% agarosgel med hjälp av en Bio-Rad Chef-DRII apparat vid 14 ° C (Catalog #: 170-3612). </li></ol> Parametrar: 1: a Block: 70s byta tid, 15 timmar på 6V/cm. 2: a Block: 120S byta tid, 11h vid 6V/cm <ol start="3"><li> Visualisera kromosomer genom färgning med 1μg/ml etidiumbromid i 30 min, bestråla med 60 mJ av UV i UV Stratalinker (Stratagene), och de-färgning i 30 min i dH 2 O. Bestråla etidiumbromid färgade kromosomer nick DNA för att möjliggöra effektiv överföring till membranet. </li><li> Överför kromosomer till ett positivt laddade membran (Hybond N +, GE Healthcare Produktkod:. RPN303B) genom kapillärkraft i denatureringen förhållanden (0.4N NaOH, 1,5 M NaCl). </li><li> Hybridisera med 32 P-märkt probe erhålls genom slumpmässiga priming (Amersham Biosciences Produktkod:. RPN1604) med en 1,8 kb BamHI / BamHI genomisk klon som innehåller HIS3 gen 17. </li><li> Visualisera kromosomer genom autoradiografi eller phosphorimaging. </li></ol> 5. Representativa resultat: En grafisk representation av translokation analysen är avbildad på kromosom nivå (figur 1). En schematisk av experimentella proceduren visas också (Figur 2A). Både före och efter-induktion plätering effektivitet bestäms genom att dividera det totala antalet livsdugliga, kolonibildande celler genom att det totala antalet celler organ i den kultur bestäms av hemacytometer räknare (Figur 4B). Före och efter induktion plätering effektivitet skiljde sig inte signifikant för vildtyp celler (p-värde = 0,1400) (Tabell 1). <img src="/files/ftp_upload/3150/3150table1.jpg" alt="Tabell 1" /> Tabell 1. Före och efter induktion bordläggning effektivitet i vildtyp celler. en Antalet celler organ per milliliter bestäms av hemacytometer räknas. b antalet livsdugliga celler per milliliter bestäms av bordläggning lämpliga spädningar på icke-selektivt medium för att producera ~ 100-200 kolonier. C före och efter induktion plätering effektivitet bestäms genom att dividera det totala antalet livsdugliga, kolonibildande, celler med det totala antalet celler organ i kulturen, bestäms av hemacytometer räknas. Detta tyder på att närvaron eller frånvaron av antingen translokation kromosom inte påverka förmågan att överleva DSB bildas. Frekvensen av kromosomala translokationer kan beräknas genom att dividera antalet kolonier histidin prototrophic med det totala antalet livskraftiga celler bestäms av bordläggningen på YPD (Figur 2B). Denna analys kan utföras med stammar av olika genotyp för att identifiera hur förlusten av proteiners funktion påverkar SSA (dvs. rad51Δ - / -). Rekombination frekvenser bestämmas i olika stammar kan sedan diagram för att jämföra skillnader i möjligheterna för dessa stammar att reparera HO-endonuclease inducerad DSBs genom SSA (figur 2C). Translokation frekvenser erhålls med vildtyp diploida stammen vid selektiv (2.2x10 -2) och icke-selektiva (2.17x10 -2) förhållandena var inte statistiskt skilt från varandra (p-värde = 0,9131), medan translokation frekvenser erhålls selektivt (6.0x10 -2) och icke-selektivt (11.9x10 -2) med rad51Δ - / - homozygota liknade men statistiskt olika (p-värde = 0,0089). De frekvenser som erhålls både selektivt (p-värde = 0,0001) och icke-selektivt (p-värde = 0,0002) med Rad51 ° - / - homozygota var statistiskt skiljer sig från de som erhålls med motsvarande villkor med vildtyp stam. Förmodade translokation bärande kloner kan ytterligare undersökas av genomiska Southern blot och kromosomala analyser blot (Figur 3). För Södra analys är genomisk DNA kokas tillsammans med BamHI endonuclease före agarosgelelektrofores, avtorkning och hybridisering med ett 32P-märkta 1.8kb HIS3 sond för att visualisera den diagnostiska 0,8 kb his3Δ200, 1,7 kb his3-Δ3 &#39;, 4 kb tIII:: XV, 5 kb tXV:: III, och 8 kb his3-Δ5 &quot;fragment (Figur 3B.1) . Intakt kromosomerna kan framställas, separerade med CHEF (Figur 3B.2), utplånade till nylon och hybridiseras med 32 P-märkta 1,8 kb HIS3 sond för att visualisera 1,1 Mb intakt kromosom XV, 0,8 Mb tXV: III translokation kromosom, 0,6 Mb tIII: XV translokation kromosom, och 0,3 Mb intakt kromosom III (Figur 3B.3). En grafisk karta som visar förväntad BamHI endonuclease-rötas genomisk DNA-fragment, och föräldrar och rekombinant kromosomer, avbildas (Figur 3A). <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1. Bildning av translokation kromosomer genom enkelsträngbrott glödgning (SSA). 1) DSBs skapas på his3-Δ3 &quot;och his3-Δ5&quot; substrat (kromosomer XV och III, respektive) med HO endonuclease efter tillägg av galaktos till kulturer. 2) DSBs bearbetas för att generera 3 &quot;single-trådarna i ändarna av den trasiga kromosomer. 3) SSA maskiner anneals kompletterande 311 eller 60 nukleotid enkelsträngade HIS3 sekvenser bildas vid varje rekombination substrat. Icke-homologa svansar som bildas vid glödgning avlägsnas genom endonuclease matsmältningen. Kompletterande fyra bp överhäng på de återstående kromosomala fragment som bildas av HO-endonuclease rötning kan också glödga. 4) Ligation avslutar skapandet av en intakt HIS3 genen och tXV:: III translokation kromosom av SSA. Celler bär denna kromosom kan väljas för deras förmåga att växa på medellång saknas histidin. Ligatur kan också skapa de ömsesidiga tIII:: XV translokation kromosom med en NHEJ-liknande mekanism. <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig2.jpg" alt="Figur 2" /> Figur 2. Analys för bestämning av frekvensen för translokation av SSA. A) En ml YPGly / Lac kulturer inokuleras med enstaka kolonier av celler av en utvald genotyp och vuxit till en lämplig täthet av ca 5x10 7-1x10 8 celler / ml. Galaktos läggs till en slutlig koncentration på 2% för att skapa DSBs vid rekombination substrat på kromosomerna III och XV. Att genomföra analysen vid selektiv förhållanden är lämpliga spädningar görs så att ungefär 100 till 200 celler är pläterade på YPD och ett tillräckligt antal celler är pläterade på medelhög saknas histidin ge en märkbar del av hans + rekombinant kolonier. Att genomföra analysen utan val kommer ungefär 100 till 200 celler pläterat på YPD, odlas för två till tre dagar till enstaka kolonier och sedan replik klädd på medelhög saknas histidin. B) translokation frekvens kan beräknas genom att dividera antalet kolonier som växer på hans plattor av andelen som växer på YPD. C) Flyttning frekvenser av stammar av olika genotyp (dvs vildtyp och rad51Δ - / -) kan plottas att jämföra skillnader i möjligheterna för dessa stammar att reparera DSBs av SSA. <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig3.jpg" alt="Figur 3" /> Figur 3. Fastställande plätering effektivitet. (A) en alikvot av celler tas från natten kultur före och efter DSB induktion, är lämpliga spädningar görs, följt av en hemacytometer räkna att fastställa det totala antalet celler organ per ml av kulturen. Lämpliga spädningar är pläterade på icke-selektivt medium för att bestämma det totala antalet livskraftiga celler per ml, genom att räkna kolonierna som visas på YPD. (B) plätering effektivitet bestäms sedan genom att dividera det totala antalet livskraftiga celler med det totala antalet celler kroppar, och multiplicera kvoten med 100. <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig4.jpg" alt="Figur 4" /> Figur 4. Upptäckt av kromosomal translokation händelser genom genomiska Southern blot och kromosom analyser blot. A) Grafisk representation av relevanta kromosomer före (vänster) och efter (höger) translokation bildas. Storlekar av förälder och rekombinanta kromosomer listas i megabase-par (Mb). Storlekar av begränsning fragment som innehåller relevanta sekvenser genereras av BamHI nedbrytning av genomiska DNA från förälder och rekombinanta stammar, och avslöjade på blotting genom hybridisering med ett 1,8 kb BamHI HIS3 genomisk klon, redovisas i kilobase-par (kb). Kromosomer är inte skalenlig. B) Fysisk analys av förmodade translokation-bärande kloner. (1) Genomic Southern blot-analys - Genomiskt DNA samlas in och rötas med BamHI begränsning endonuclease, fraktionerade med gelelektrofores, blotted till nylon och hybridiseras till en 32 P-märkt 1,8 kb HIS3 sond för att visualisera följande fragment: 0,8 kbyte his3Δ200, 1,7 kb his3-Δ3 &#39;, 4 kb tIII:: XV, 5 kb tXV:: III, och 8 kb his3-Δ5 &quot;. Lanes: a) förälder diploid, b) Hans + icke-ömsesidiga translokation rekombinant, c) Hans + ömsesidig translokation rekombinant. (2) CHEF geler - Intakt kromosomer har upprättats i agaros pluggar, åtskilda av CHEF, färgade med etidiumbromid och visualiseras under UV-ljus. Lanes: Som ovan. (3) Kromosom blotting - Avskilda kromosomer var utplånade till nylon och hybridiseras med 32 P-märkta 1,8 kb HIS3 sond för att visualisera följande kromosomerna: 1,1 Mb intakt kromosom XV, 0,8 Mb tXV: III translokation kromosom, 0,6 Mb tIII: XV translokation kromosom, och 0,3 Mb intakt kromosom III. Lanes: Som ovan.

<ol>
	<li>Sen, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+genomic+deletions+mediated+by+recombination+between+Alu+elements.">Human genomic deletions mediated by recombination between Alu elements.</a> The American Journal of Human Genetics. 79, 41-53 (2006).</li><li>Han, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alu+recombination-mediated+structural+deletions+in+the+chimpanzee+genome.">Alu recombination-mediated structural deletions in the chimpanzee genome.</a> Plos Genetics. 3, 1939-1949 (2007).</li><li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copy+number+variation+in+human+health,+disease,+and+evolution.">Copy number variation in human health, disease, and evolution.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 10, 451-481 (2009).</li><li>Goodier, J. L., Kazazian, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrotransposons+revisited:+The+restraint+and+rehabilitation+of+parasites.">Retrotransposons revisited: The restraint and rehabilitation of parasites.</a> Cell. 135, 23-35 (2008).</li><li>Lanktree, M., Hegele, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copy+number+variation+in+metabolic+phenotypes.">Copy number variation in metabolic phenotypes.</a> Cytogenet Genome Res. 123, 169-175 (2008).</li><li>Mullighan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+genetic+alterations+in+acute+lymphoblastic+leukaemia.">Genome-wide analysis of genetic alterations in acute lymphoblastic leukaemia.</a> Nature. 446, 758-764 (2007).</li><li>Mattarucchi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microhomologies+and+interspersed+repeat+elements+at+genomic+breakpoints+in+chronic+myeloid+leukemia.">Microhomologies and interspersed repeat elements at genomic breakpoints in chronic myeloid leukemia.</a> Genes Chromosomes Cancer. 47, 625-632 (2008).</li><li>Stenger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biased+distribution+of+inverted+and+direct+Alus+in+the+human+genome:+implications+for+insertion,+exclusion,+and+genome+stability.">Biased distribution of inverted and direct Alus in the human genome: implications for insertion, exclusion, and genome stability.</a> Genome Res. 11, 12-27 (2001).</li><li>Hedges, D., Deininger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inviting+instability:+Transposable+elements,+double-strand+breaks,+and+the+maintenance+of+genome+integrity.">Inviting instability: Transposable elements, double-strand breaks, and the maintenance of genome integrity.</a> Mutat Res. 616, 46-59 (2007).</li><li>Symington, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+RAD52+epistasis+group+genes+in+homologous+recombination+and+double-strand+break+repair.">Role of RAD52 epistasis group genes in homologous recombination and double-strand break repair.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 66, 630-670 (2002).</li><li>Lewis, L., Resnick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tying+up+loose+ends:+nonhomologous+end-joining+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Tying up loose ends: nonhomologous end-joining in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mutat Res. 451, 71-89 (2000).</li><li>Pannunzio, N. R., Manthey, G. M., Bailis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAD59+is+required+for+efficient+repair+of+simultaneous+double-strand+breaks+resulting+in+translocations+in+Saccharomyces+cerevisiae.">RAD59 is required for efficient repair of simultaneous double-strand breaks resulting in translocations in Saccharomyces cerevisiae.</a> DNA Repair (Amst). 7, 788-800 (2008).</li><li>Nicholas, R., Pannunzio, G. M. M., Bailis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAD59+and+RAD1+cooperate+in+translocation+formation+by+single-strand+annealing+in+Saccharomyces+cerevisiae.">RAD59 and RAD1 cooperate in translocation formation by single-strand annealing in Saccharomyces cerevisiae.</a> Curr Genet. 56, 87-100 (2010).</li><li>Manthey, G. M., Bailis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad51+Inhibits+Translocation+Formation+by+Non-Conservative+Homologous+Recombination+in+Saccharyomyces+cerevisiae.">Rad51 Inhibits Translocation Formation by Non-Conservative Homologous Recombination in Saccharyomyces cerevisiae.</a> Plos One. 5, (2010).</li><li>Hoffman, C. S., Winston, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ten-minute+DNA+preparation+from+yeast+efficiently+releases+autonomous+plasmids+for+transformation+of+Escherichia+coli.">A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli.</a> Gene. 57, 267-272 (1987).</li><li>Sambrook, J., MacCallum, P., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2001).</li><li>Iadonato, S. P., Gnirke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RARE-cleavage+analysis+of+YACs.">RARE-cleavage analysis of YACs.</a> Methods Mol. Biol. , 75-85 (1999).</li><li>Argueso, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand+breaks+associated+with+repetitive+DNA+can+reshape+the+genome.">Double-strand breaks associated with repetitive DNA can reshape the genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 11845-11850 (2008).</li><li>Batzer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alu+repeats+and+human+disease.">Alu repeats and human disease.</a> Molecular Genetic Metabolism. 67, 183-193 (1999).</li><li>Fasullo, M., Dave, P., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-damaging+agents+stimulate+the+formation+of+directed+reciprocal+translocations+in+Saccharomyces+cerevisiae.">DNA-damaging agents stimulate the formation of directed reciprocal translocations in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mutat. Res. 314, 121-133 (1994).</li><li>Richardson, C., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+chromosomal+translocations+induced+by+DNA+double-strand+breaks.">Frequent chromosomal translocations induced by DNA double-strand breaks.</a> Nature. 405, 697-700 (2000).</li><li>Look, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+altered+by+chromosomal+translocations+in+leukemias+and+lymphomas.">Genes altered by chromosomal translocations in leukemias and lymphomas.</a> The Genetic Basis of Human Cancer. , (2002).</li><li>Fasullo, M. T., Davis, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direction+of+chromosome+rearrangements+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+use+of+his3+recombinational+substrates.">Direction of chromosome rearrangements in Saccharomyces cerevisiae by use of his3 recombinational substrates.</a> Mol. Cell. Biol. 8, 4370-4380 (1988).</li><li>Manthey, G. M., Naik, N., Bailis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Msh2+Blocks+an+Alternative+Mechanism+for+Non-Homologous+Tail+Removal+during+Single-Strand+Annealing+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Msh2 Blocks an Alternative Mechanism for Non-Homologous Tail Removal during Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae.</a> PLoS One. 4, e7488-e7488 (2009).</li><li>Muller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-course+of+radiation-induced+chromosomal+aberrations+in+tumor+patients+after+radiotherapy.">Time-course of radiation-induced chromosomal aberrations in tumor patients after radiotherapy.</a> Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 63, 1214-1220 (2005).</li><li>Lin, F. L., Sperle, K., Sternberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+for+homologous+recombination+during+transfer+of+DNA+into+mouse+L+cells:+role+of+DNA+ends+in+the+recombination+process.">Model for homologous recombination during transfer of DNA into mouse L cells: role of DNA ends in the recombination process.</a> Mol. Cell. Biol. 4, 1020-1034 (1984).</li><li>Ivanov, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Requirements+for+the+single-strand+annealing+pathway+of+double-strand+break+repair+in+Saccharyomyces+cerevisiae.">Genetic Requirements for the single-strand annealing pathway of double-strand break repair in Saccharyomyces cerevisiae.</a> Genetics. 142, 693-704 (1996).</li></ol>

Inga intressekonflikter deklareras.

Höga doser av joniserande strålning utgör en inneboende risk för genomet instabilitet genom produktion av ett stort antal DSBs 19. Eukaryota genom är fyllda med repetitiva sekvenser som är utmärkta substrat för att generera flyttning och andra omstruktureringar genomiska 20,21. Kromosomal flyttning av HR ofta iakttas vid DSBs införs mellan repetitiva sekvenser 12,21,22. Överväldigande bevis tyder på att mycket av genomisk instabilitet i samband med leukemi och lymfom kan hänföras till kromosomala translokationer, betonar vikten av att förstå hur denna mekanism sker i eukaryoter 22,23. Vi har utvecklat ett system i spirande jäst för att undersöka bildandet av translokation kromosomer DSB-inducerad HR mellan kort regioner homologi på olika kromosomer som liknar storleken på repetitiva element spridda över hela jäst och mänskliga genomet. I analysen är his3-Δ3 flyttning substrat ligger på ett exemplar av kromosom XV. Den andra his3 allelen (his3-Δ200) har en ~ 1KB strykning av HIS3 promotor och kodning sekvens som förhindrar denna sekvens används som en mall för reparation 24. Den his3-Δ5 &quot;substrat ligger vid LEU2 locus på ett exemplar av kromosom III, med andra exemplar av kromosom III innehåller en oförändrad LEU2 allelen (Figur 1). En galaktos-inducerbara HO endonuclease uttryck kassett märkt med KAN-MX infördes i TRP1 locus i kromosom IV (trp1:: GAL-HO-kan-MX). Varje translokation substrat flankeras av ett HO-endonuclease erkännande sekvens som kan riktas för klyvning genom att inducera uttryck av HO-genen genom tillägg av galaktos till mediet. Efter HO-endonuclease inducerad spjälkning vid his3-Δ3 &quot;och his3-Δ5&quot; substrat, kan celler använder effektivt den delade korta tarmkanalen av HIS3 sekvenshomologi (311 bp eller 60 BP) för att reparera den trasiga kromosomer av HR, vilket genererar en translokation kromosom med en intakt HIS3 allel 12-14,25. Eftersom föräldern celler saknar en intakt kopia av den HIS3 gen, de är oförmögna att växa på sitt medium. Endast celler som har genomgått den translokation evenemanget kan väljas på medellång saknas histidin. Därför kan frekvensen av kromosomavvikelser translokationer beräknas genom att dividera antalet kolonier histidin prototrophic med det totala antalet livskraftiga celler pläterade, bestäms av bordläggningen på YPD. Genomiska DNA och intakta kromosomer kan sedan isoleras från representativa Hans + kolonier, och närvaron av en translokation kromosom verifieras av genomiska södra och kromosom analyser blot. Noggrann analys har gett oss möjlighet att samla in ytterligare viktig information om analysen 12. Genomic Southern blot-analys har gett bevis för att det är praktiskt taget fullständig skärning av kromosomer XV och III efter 30 minuter av HO-endonuclease induktion, och därför finns det ingen betydande bakgrund av oklippt kromosomala substrat i befolkningen (G. Manthey &amp; A. Bailis, opublicerade resultat). Genomisk Södra och kromosom blot analyser av Hans - överlevare indikerar att cellerna ofta förlorar en, den andra, eller båda kromosomerna klippa och förbli lönsamma (L. Liddell &amp; A. Bailis, opublicerade resultat). Viktigt är de nästan lika bordläggning effektivitet på icke-selektivt medium före och efter induktion av uttryck av HO-endonuclease visar att varken fel att reparera trasiga kromosomer, eller underlåtenhet att behålla translokation kromosomerna påverkar förmågan att överleva DSB bildas. I överensstämmelse med detta, tXV: III translokation kromosom har visat sig vara instabil i mitotiska celler i frånvaro av valet. Detta visades genom att växa tXV:: III innehåller Hans + rekombinanter natten icke-selektivt, plätering enstaka kolonier på icke-selektiva plattor, och replik plätering på selektivt medium saknas histidin. Tio till 70% av de kolonier som uppstår på dessa plåtar hade förlorat tXV:: III translokation kromosom (N. Pannunzio &amp; A. Bailis, opublicerade resultat). Translokation kromosomer som genereras av IR-exponeringen hos människa uppvisar en liknande instabilitet 26. Detta tyder på att translokation bildningen kan bidra till tidig händelser i Tumörgenesens genom att främja förlust av heterozygositet. För det andra, omfattande genetiska och molekylära analyser tyder på att SSA, är en effektiv och obligatoriskt icke-konservativa mekanism HR, den primära mekanismen för translokation bildandet av HR efter samtidiga bildandet av DSBs på två kromosomer 12,27,28. Detta samarbetensistent med konstaterandet att stora doser av IR resultera i en täthet av DSBs tillräckligt för att skapa pauser i anslutning till flera repetitiva sekvenser i jästgenomet och en hög frekvens av translokation bildandet av HR. Tillsammans utgör dessa observationer tyder på att onkogena effekten av IR-exponeringen hos människa kan, delvis en följd av reparation av DSBs av en effektiv mekanism för HR som genererar translokationer som genom sina inneboende instabilitet, främja genetiska förändringar som lanseras Tumörgenesens. Eftersom strålning används ofta för att behandla cancer, genomet omflyttningar som beror på reparationer av strålningsinducerad DSBs kan bidra till uppkomsten av sekundär cancer som uppkommer ofta hos patienter. Således kan denna modell hjälpa oss att få en bättre förståelse av de genetiska och molekylära grunden för ett viktigt kliniskt svar till IR-behandling.

quantitation and analysis of the formation of ho-endonuclease stimulated chromosomal translocations by single-strand annealing in saccharomyces cerevisiae

Genetisk variation är ofta förmedlas av genomisk omdisponeringar som uppstår genom interaktion mellan spridda repetitiva element finns i alla eukaryota genomet. Denna process är en viktig mekanism för att generera mångfald inom och mellan organismer 1-3. Det mänskliga genomet består av cirka 40% repetitiva sekvensen av retrotransposon ursprung, inklusive olika linjer och SINES 4. Börsen händelser mellan dessa repetitiva element kan leda till arvsmassan omdisponeringar, inklusive translokationer, som kan störa gen dosering och uttryck som kan resultera i autoimmuna och hjärt-kärlsjukdomar 5, liksom cancer hos människor 6-9. Utbyte mellan repetitiva element förekommer i en mängd olika sätt. Utbyte mellan sekvenser som aktien perfekt (eller nästan perfekt) homologi sker genom en process som kallas homolog rekombination (HR). Däremot icke-homologa slut att gå (NHEJ) använder små-eller-inget sekvenshomologi för utbyte 10,11. Det främsta syftet med HR i mitotiska celler, är att reparera dubbla strängbrott (DSBs) som genereras endogent med avvikande DNA-replikation och oxidativa skador, eller av exponering för joniserande strålning (IR) och andra exogena DNA-skada agenter. I analysen beskrivs här, är DSBs samtidigt skapas gränsar rekombination substrat på två olika kromosomala loci i diploida celler av en galaktos-inducerbara HO-endonuclease (Figur 1). Reparation av trasiga kromosomer genererar kromosomala flyttning av sträng glödgning (SSA), är en process där homolog sekvenser i anslutning till kromosom ändarna kovalent gick efter glödgning. En av substrat, his3-Δ3 &quot;, innehåller en 3&quot; stympad HIS3 allel och ligger på ett exemplar av kromosom XV på infödda HIS3 locus. Den andra substrat, his3-Δ5 &quot;, ligger vid LEU2 locus om ett exemplar av kromosom III, och innehåller en 5&quot; stympad HIS3 allel. Båda substrat flankeras av en HO endonuclease erkännande webbplats som kan riktas till snitt av HO-endonuclease. HO endonuclease erkännande platser hemma i MAT locus, på båda kopiorna av kromosomen III har strukits i alla stammar. Detta hindrar samspelet mellan rekombination substrat och andra brutna ändar kromosom från inblandning i analysen. Det KAN-MX-märkt galaktos-inducerbara HO endonuclease uttryck kassett är isatt på TRP1 locus på kromosom IV. Det substrat aktien 311 bp och 60 bp i HIS3 kodande sekvens som kan användas av HR-maskiner för reparation av SSA. Celler som använder dessa substrat för att reparera trasiga kromosomer av HR bildar en intakt HIS3 allel och en tXV:: III kromosomal translokation som kan väljas för den förmåga att växa på medium saknas histidin (Figur 2A). Translokation frekvens av HR beräknas genom att dividera antalet histidin prototrophic kolonier som uppstår på selektivt medium med det totala antalet livskraftiga celler som uppstår efter bordläggning lämpliga spädningar på icke-selektivt medium (Figur 2B). En mängd olika mutanter DNA-reparation har använts för att studera den genetiska kontrollen av translokation bildande genom SSA med detta system 12-14.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae at 

Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae

HO-stimulerad translokation analys övervakar enkelsträngbrott glödgning efter bildandet av DNA dubbel-strängbrott på flera loci i diploid<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Denna mekanism kan modell genomet omdisponeringar i kroppsceller från högre eukaryoter efter exponering för höga doser av joniserande strålning.

Kvantifiering och analys av bildandet av HO-Endonuclease stimulerad Kromosomala Translokationer av enkelsträngbrott Glödgning i Saccharomyces cerevisiae</em

Genetic variation is frequently mediated by genomic rearrangements that arise through interaction between dispersed repetitive elements present in every ...

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Dissekering av Saccharomyces cerevisiae ASCI

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Kvantitativa Phosphoproteomics i Fatty Acid Stimulerade Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Tissue Samples

Kvantifiering av γH2AX foci i vävnadsprover

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray Analys för Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

En fluorescensmikroskopi-analys för övervakning Mitophagy i jästen Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expression och rening av den cystisk fibros transmembran konduktans-regulator protein i Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisering och analys av mRNA-molekyler användning av fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Kopplade Analyser för övervakning Proteinåterveckningssteg i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Rening av cystisk fibros transmembran konduktansregulator Protein Uttryckt i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

EPR Övervakad Redoxtitrering av kofaktorer av<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; NÄR1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...