Name: preparation of viral dna from nucleocapsids
Uploaded: 2011-08-16T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids at JoVE.com

الكتاب نقدر مساهمات سميث جريج ، بوميرانز ليزا ، ليمان مات ، إلدريدج مارليس ، Halina Goraczniak Staniszewska ، وأعضاء في مختبر Enquist هذا البروتوكول صقل.

1. اليوم الأول : العدوى الفيروسية وإعداد المخازن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد أطباق 10/05 (15 سم القطر) من خلايا الأنسجة للعدوى ، مثل خلايا PK - 15 لفيروس داء الكلب الكاذب (PRV) أو خلايا فيرو لفيروس الهربس البسيط (HSV). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما ا?...

<ol>
	<li>Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+variability+in+clinical+and+laboratory+isolates+of+herpes+simplex+virus+1+reveals+new+mutations.">Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations.</a> J Virol. 84, 5303-5313 (2010).</li><li>Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+pseudorabies+virus+strains+expressing+red+fluorescent+proteins:+new+tools+for+multisynaptic+labeling+applications.">Development of pseudorabies virus strains expressing red fluorescent proteins: new tools for multisynaptic labeling applications.</a> J Virol. 77, 10106-10112 (2003).</li><li>Kobiler, O., Lipman, Y., Therkelsen, K., Daubechies, I., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpesviruses+carrying+a+Brainbow+cassette+reveal+replication+and+expression+of+limited+numbers+of+incoming+genomes.">Herpesviruses carrying a Brainbow cassette reveal replication and expression of limited numbers of incoming genomes.</a> Nat Commun. 1, 146-146 (2010).</li><li>Enquist, L. W., Madden, M. J., Schiop-Stanley, P., Vande Woude, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+herpes+simplex+type+1+DNA+fragments+in+a+bacteriophage+lambda+vector.">Cloning of herpes simplex type 1 DNA fragments in a bacteriophage lambda vector.</a> Science. 203, 541-544 (1979).</li><li>Smith, G. A., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+transposon+mutagenesis+in+Escherichia+coli+of+a+full-length+infectious+clone+of+pseudorabies+virus,+an+alphaherpesvirus.">Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus.</a> J Virol. 73, 6405-6414 (1999).</li><li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of virology. , (2008).</li><li>Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+pseudorabies+virus:+impact+on+neurovirology+and+veterinary+medicine.">Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 69, 462-500 (2005).</li><li>Roizman, B., Pellett, P. E., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields Virology. , 2381-2397 (2001).</li><li>Mendez, I. I., Hermann, L. L., Hazelton, P. R., Coombs, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+analysis+of+freon+substitutes+in+the+purification+of+reovirus+and+calicivirus.">A comparative analysis of freon substitutes in the purification of reovirus and calicivirus.</a> J Virol Methods. 90, 59-67 (2000).</li><li>Gharabaghi, F., Aymard, M., Trotemann, P., Gerdil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+simplified+micromethod+for+subtyping+varicella-zoster+virus.">A rapid and simplified micromethod for subtyping varicella-zoster virus.</a> J Med Virol. 31, 129-134 (1990).</li><li>Granstedt, A. E., Szpara, M. L., Kuhn, B., Wang, S. S., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+monitoring+of+in+vivo+neural+activity+using+a+circuit-tracing+pseudorabies+virus.">Fluorescence-based monitoring of in vivo neural activity using a circuit-tracing pseudorabies virus.</a> PLoS One. 4, e6923-e6923 (2009).</li></ol>

وقد وضعت أصلا أجزاء من هذا البروتوكول لعزل الحمض النووي الفيروسي في BSL4 الظروف ، لكنه يتكيف بشكل جيد على قدم المساواة لغير BSL شروطه. 4 ونحن عادة ما تستخدم هذا البروتوكول لعزل الحمض النووي من PRV ألفا herpesviruses وHSV - 1 ، التي الجينوم الحمض النووي المغلقة في قفيصة البروتي...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> الفريون (1،1،2 ثلاثي كلورو - 1 - ،2،2 trifluoroethane) </td><td> الصياد </td><td> T178 - 4 </td><td> تحقق مع المؤسسة للحصول على المبادئ التوجيهية بشأن التخلص المناسب من النفايات المحتوية على غاز الفريون أو راجع منديز وآخرون. عن بدائل محتملة الفريون 9 </td></tr><tr><td> أنابيب المرحلة هلام قفل ، والقدرات 15ml الثقيلة </td><td> 5 PRIME </td><td> 2302850 </td><td> اختياري </td></tr><tr><td> أنابيب Polyallomer نابذة فائقة السرعة </td><td> بيكمان * </td><td> 331372 * </td><td> * حدد أنابيب ملائمة لنابذة فائقة السرعة الخاصة بك ، ويتم تضمين هذه كمثال فقط </td></tr><tr><td> NP - 40 / IGEPAL </td><td> سيغما </td><td> I - 3021 </td><td></td></tr><tr><td> PK - 15 الخلايا </td><td> ATCC </td><td> CCL - 33 </td><td></td></tr><tr><td> خلايا فيرو </td><td> ATCC </td><td> CCL - 81 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> HyClone </td><td> SH30028.03 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of viral dna from nucleocapsids

الفيروسات هي طفيليات تلزم الخلوية ، وبالتالي فإن دراسة عينات من الحمض النووي الفيروسي يتطلب عزل المواد بعيدا عن الملوثات الخلية المضيفة والحمض النووي. تطبيقات المصب عدة تتطلب كميات كبيرة من الحمض النووي الفيروسي النقي ، والتي يتم توفيرها من قبل هذا البروتوكول. وتشمل هذه التطبيقات تسلسل الجينوم الفيروسي ، حيث إزالة الحمض النووي المضيف أمر حاسم لتحسين بيانات الناتج عن تسلسل الفيروسي ، وإنتاج سلالات جديدة المؤتلف الفيروسية ، حيث شارك في 1،2 ترنسفكأيشن تنقيته من الحمض النووي الفيروسي البلازميد ويسهل إعادة التركيب الخطي. ، 3 هذا الإجراء يستخدم مزيجا من عمليات الاستخراج وكثافة المستندة الطرد المركزي لعزل الحمض النووي المنقى خطية هربس nucleocapsid من الخلايا المصابة. 4،5 الخطوات الأولية تهدف إلى تنقية عزل الفيروسية capsids المنقى ، والتي تحتوي على الحمض النووي الفيروسي حماية خلال عمليات الاستخراج والخطوات الطرد المركزي التي تعمل على إزالة البروتينات والحمض النووي الخلوي. تحلل من النشرات nucleocapsids ثم الحمض النووي الفيروسي ، واثنين النهائي الفينول كلوروفورم خطوات إزالة البروتينات المتبقية. القبض على الحمض النووي النهائي من الحل يتركز عالية ونقية ، مع 260/280 OD 1.90 متوسط. اعتمادا على كمية من الخلايا المصابة المستخدمة ، غلة مجموعة الحمض النووي الفيروسي 150-800 ميكروغرام أو أكثر. نقاء من هذا الحمض النووي يجعلها مستقرة خلال التخزين الطويل الأجل في 4C. وبالتالي هذا الحمض النووي مناسبة بشكل مثالي لسرعة عالية التسلسل عالية الدقة تفاعلات PCR ، وtransfections. قبل بداية البروتوكول ، فمن المهم أن نعرف أن متوسط ​​عدد الخلايا في الطبق (على سبيل المثال ما معدله 8 × 10 خلايا PK - 15 6 متكدسة في صحن 15 سم) لاستخدامها ، وعيار من المخزون الفيروسي ( مثال 1 × 10 8 البلاك تشكيل وحدات لكل مل). هذه ضرورية لحساب تعدد المناسب للعدوى (وزارة الداخلية) للبروتوكول. 6 وعلى سبيل المثال ، لتصيب طبق واحد من 15 سم PK - 15 مع الخلايا الفيروسية الأسهم في أعلاه ، في وزارة الداخلية من 5 ، يمكنك استخدام ميكرولتر من 400 الأسهم الفيروسية وتمييع مع 3.6 مل من المتوسط ​​(إجمالي حجم تلقيح لمدة 4 مل صفيحة 15 سم). يمكن إعداد التحضيرات متعددة الحمض النووي الفيروسي في نفس الوقت. ويقتصر عدد التحضيرات في وقت واحد فقط من قبل عدد من الأنابيب التي عقدها الدوار نابذة فائقة السرعة (واحدة لكل فيروس ، انظر الخطوة 3.9 أدناه). نحن هنا وصف الإجراء كما لو يجري لأحد الفيروسات.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids at JoVE.com

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

نحن تصف عملية عزل الحمض النووي عالية النقاء هربس nucleocapsid من الخلايا المصابة. القبض على الحمض النووي النهائي من الحل هو تركيز عالية ونقاء ، مما يجعله مثاليا للالتسلسل عالية الإنتاجية ، وارتفاع الإخلاص تفاعلات PCR ، وtransfections لإنتاج recombinants الفيروسية الجديدة.

إعداد الحمض النووي الفيروسي من Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

توليد المؤتلف فيروسات الأنفلونزا من الحمض النووي البلازميد

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

باستخدام الفحص ميكروأري عموم الفيروسي (Virochip) إلى الشاشة العينات السريرية لمسببات الأمراض الفيروسية

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

بمعزل عن المتغيرات الاخلاص للفيروسات الحمض النووي الريبي وتوصيف التردد يتحور الفيروس

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

فصل واحدة الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي ، والحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل ، والحمض النووي الريبي من جالية الفيروسية البيئة باستخدام الكروماتوغرافيا هيدروكسيباتيت

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A Chelex بروتوكول بسيط لاستخراج الحمض النووي من<em&gt; الأنوفيلة</em&gt; النيابة.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

إرساء ثقافة السائل المغطاة من مجرى الهواء الإنسان المستقطب طلائي Calu-3 خلايا لدراسة استجابة الخلية المضيفة لمسببات الأمراض التنفسية<em&gt; في المختبر</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

متوسط ​​الفيروسية مغلف جلايكوبروتين المسامير من الكترون Cryotomography إعادة بناء باستخدام Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

العزلة الفيروسية النسخ المتماثل حجرة التخصيب النووي الكسور الفرعية من اتش المصابة الخلايا الطبيعية الإنسان

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

تطوير بوساطة حلقة-المجففة بالتبريد متساوي التضخيم الكواشف للكشف عن<em&gt; الكوكسيلا البورنيتية</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...