Name: preparation of viral dna from nucleocapsids
Uploaded: 2011-08-16T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids at JoVE.com

De auteurs waarderen de bijdragen van Greg Smith, Lisa Pomeranz, Matt Lyman, Marlies Eldridge, Halina Staniszewska Goraczniak, en leden van de Enquist lab in fine-tuning van dit protocol.

1. Eerste dag: virale infectie en voorbereiding van buffers <ol><li> Bereid 50-10 gerechten (15 cm diameter) van weefselkweek cellen voor infectie, bijvoorbeeld PK-15 cellen voor pseudorabies virus (PRV) of Vero-cellen voor herpes simplex virus (HSV). </li><li> Wanneer de cellen zijn 95 - 100% confluent, infecteren ze op een (MOI) van 5-10. Om dit te doen, elke plaat met behulp van virus voorraad in een totaal volume van 4 ml per plaat te enten, dan de platen incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C. Rock platen voorzicht...

<ol>
	<li>Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+variability+in+clinical+and+laboratory+isolates+of+herpes+simplex+virus+1+reveals+new+mutations.">Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations.</a> J Virol. 84, 5303-5313 (2010).</li><li>Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+pseudorabies+virus+strains+expressing+red+fluorescent+proteins:+new+tools+for+multisynaptic+labeling+applications.">Development of pseudorabies virus strains expressing red fluorescent proteins: new tools for multisynaptic labeling applications.</a> J Virol. 77, 10106-10112 (2003).</li><li>Kobiler, O., Lipman, Y., Therkelsen, K., Daubechies, I., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpesviruses+carrying+a+Brainbow+cassette+reveal+replication+and+expression+of+limited+numbers+of+incoming+genomes.">Herpesviruses carrying a Brainbow cassette reveal replication and expression of limited numbers of incoming genomes.</a> Nat Commun. 1, 146-146 (2010).</li><li>Enquist, L. W., Madden, M. J., Schiop-Stanley, P., Vande Woude, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+herpes+simplex+type+1+DNA+fragments+in+a+bacteriophage+lambda+vector.">Cloning of herpes simplex type 1 DNA fragments in a bacteriophage lambda vector.</a> Science. 203, 541-544 (1979).</li><li>Smith, G. A., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+transposon+mutagenesis+in+Escherichia+coli+of+a+full-length+infectious+clone+of+pseudorabies+virus,+an+alphaherpesvirus.">Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus.</a> J Virol. 73, 6405-6414 (1999).</li><li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of virology. , (2008).</li><li>Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+pseudorabies+virus:+impact+on+neurovirology+and+veterinary+medicine.">Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 69, 462-500 (2005).</li><li>Roizman, B., Pellett, P. E., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields Virology. , 2381-2397 (2001).</li><li>Mendez, I. I., Hermann, L. L., Hazelton, P. R., Coombs, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+analysis+of+freon+substitutes+in+the+purification+of+reovirus+and+calicivirus.">A comparative analysis of freon substitutes in the purification of reovirus and calicivirus.</a> J Virol Methods. 90, 59-67 (2000).</li><li>Gharabaghi, F., Aymard, M., Trotemann, P., Gerdil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+simplified+micromethod+for+subtyping+varicella-zoster+virus.">A rapid and simplified micromethod for subtyping varicella-zoster virus.</a> J Med Virol. 31, 129-134 (1990).</li><li>Granstedt, A. E., Szpara, M. L., Kuhn, B., Wang, S. S., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+monitoring+of+in+vivo+neural+activity+using+a+circuit-tracing+pseudorabies+virus.">Fluorescence-based monitoring of in vivo neural activity using a circuit-tracing pseudorabies virus.</a> PLoS One. 4, e6923-e6923 (2009).</li></ol>

Delen van dit protocol zijn oorspronkelijk ontwikkeld voor viraal DNA isolatie in BSL4 omstandigheden, maar het past zich even goed aan niet-BSL omstandigheden. 4 Wij vaak dit protocol te gebruiken om DNA te isoleren van de alfa-herpesvirussen PRV en HSV-1, die DNA-genoom hebben ingesloten in een eiwitachtige capside en omgeven door een lipide envelop. 7,8 Toch is het waarschijnlijk direct aan te passen aan andere grote DNA-virussen, waaronder bèta-en gamma-herpesvirussen en adenovirussen. Vergeli...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Freon (1,1,2-trichloor-1 ,2,2-trifluorethaan) </td><td> Visser </td><td> T178-4 </td><td> Neem contact op met uw instelling voor richtlijnen voor het correcte verwijdering van Freon-houdend afval, of zie Mendez et al.. voor potentiële Freon alternatieven. 9 </td></tr><tr><td> Fase lock gel buizen, Heavy 15ml capaciteit </td><td> 5 PRIME </td><td> 2302850 </td><td> Facultatief </td></tr><tr><td> Polyallomer ultracentrifuge buizen </td><td> Beckman * </td><td> 331372 * </td><td> * Selecteer tubes geschikt is voor uw eigen ultracentrifuge, deze zijn opgenomen als een voorbeeld </td></tr><tr><td> NP-40 / Igepal </td><td> Sigma </td><td> I-3021 </td><td></td></tr><tr><td> PK-15 cellen </td><td> ATCC </td><td> CCL-33 </td><td></td></tr><tr><td> Vero cellen </td><td> ATCC </td><td> CCL-81 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30028.03 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of viral dna from nucleocapsids

Virussen zijn obligate cellulaire parasieten, en dus de studie van hun DNA te isoleren vereist viraal materiaal uit de buurt van de gastheercel verontreinigingen en DNA. Diverse afgeleide toepassingen vereisen grote hoeveelheden pure viraal DNA, die wordt verzorgd door dit protocol. Deze toepassingen omvatten virale genoom, waar het wegnemen van gastheer-DNA is cruciaal voor data-uitgang te optimaliseren voor virale sequenties, en de productie van nieuwe virale recombinante stammen, waar de co-transfectie van gezuiverd plasmide en lineaire viraal DNA vergemakkelijkt recombinatie. 1,2, 3 Deze procedure maakt gebruik van een combinatie van extracties en dichtheid op basis van centrifugatie te isoleren gezuiverd lineair herpesvirus nucleocapside DNA van geïnfecteerde cellen. 4,5 De eerste zuiveringsstappen doel om gezuiverd viraal capsiden isoleren, bevatten en het virale DNA te beschermen tijdens de extracties en centrifugeren stappen dat cellulaire eiwitten en DNA te verwijderen. Lysis van nucleocapsiden releases dan viraal DNA, en de twee laatste fenol-chloroform stappen te verwijderen resterende eiwitten. De uiteindelijke DNA veroverd op oplossing is sterk geconcentreerd en zuiver, met een gemiddelde OD 260/280 van 1.90. Afhankelijk van de hoeveelheid van de gebruikte geïnfecteerde cellen, opbrengsten van viraal DNA range 150 tot 800 ug of meer. De zuiverheid van dit DNA is het stabiel tijdens langdurige opslag bij 4C. Dit DNA is dus bij uitstek geschikt voor high-throughput sequencing, high fidelity PCR-reacties, en transfecties. Voor het begin van het protocol, is het belangrijk om te weten het gemiddeld aantal cellen per schaal (bijvoorbeeld een gemiddelde van 8 x 10 6 PK-15 cellen in een confluente 15 cm schotel) en de titer van de virale voorraad worden gebruikt ( bijv. 1 x 10 8 plaque-vormende eenheden per ml). Deze zijn nodig om de juiste multipliciteit van infectie (MOI) te berekenen voor het protocol. 6 Bijvoorbeeld, om een 15 cm schotel van PK-15 cellen met de bovenstaande virale voorraad, bij een MOI van 5 infecteren, zou u 400 pi virale voorraad en verdun het met 3,6 ml van het medium (in totaal inoculatie volume van 4 ml voor een 15 cm plaat). Meerdere viraal DNA-preparaten kunnen worden bereid op hetzelfde moment. Het aantal gelijktijdige voorbereiding wordt alleen beperkt door het aantal buizen gehouden door de ultracentrifuge rotor (een per virus, zie stap 3.9 hieronder). Hier beschrijven we de procedure zoals ook al is gedaan voor een virus.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids at JoVE.com

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

We beschrijven het proces van het isoleren van hoge zuiverheid herpesvirus nucleocapside DNA van geïnfecteerde cellen. De uiteindelijke DNA veroverd op oplossing is van de hoge concentratie en zuiverheid, waardoor het bij uitstek geschikt voor high-throughput sequencing, high fidelity PCR-reacties, en transfecties om nieuwe virale recombinanten te produceren.

De voorbereiding van Virale DNA van nucleocapsiden

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Generatie van recombinant griepvirus uit plasmide-DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Met behulp van een Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) op klinische stalen scherm voor virale pathogenen

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Isolatie van Fidelity Varianten van RNA-virussen en Karakterisering van mutatie van de virussen Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Scheiding van enkelstrengs DNA, dubbelstrengs DNA en RNA van een milieu-Viral Gemeenschap met behulp van Hydroxyapatite Chromatografie

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Een eenvoudige Chelex protocol voor DNA-extractie van<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Tot oprichting van een Liquid bedekte cultuur van gepolariseerde menselijke luchtwegen Epiteel Calu-3 cellen aan Host Cell Reactie op respiratoire pathogenen Studie<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Oprichting van een<em&gt; In vitro</em&gt; Systeem om Intracellular Gedrag van Studie<em&gt; Candida glabrata</em&gt; In Human THP-1 macrofagen

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

Een gemiddelde van virale envelop glycoproteïne Spikes uit Electron Cryotomography Reconstructies met Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

Isolatie van virale replicatie compartiment verrijkt Sub-nucleaire fracties uit adenovirus-geïnfecteerde normale menselijke cellen

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

De ontwikkeling van gevriesdroogde Loop-gemedieerde Isotherme Amplification reagentia voor de detectie van<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...