Name: preparation of viral dna from nucleocapsids
Uploaded: 2011-08-16T12:00:00
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Les auteurs ont apprécié les contributions de Greg Smith, Lisa Pomeranz, Matt Lyman, Marlies Eldridge, Halina Staniszewska Goraczniak, et des membres du laboratoire Enquist à peaufiner ce protocole.

1. Premier jour: Infection virale et la préparation des tampons <ol><li> Préparez des plats 5-10 (15 cm de diamètre) de cellules de culture tissulaire de l&#39;infection, par exemple cellules PK-15 pour le virus de la pseudo-rage (PRV) ou des cellules Vero pour l&#39;herpès simplex virus (HSV). </li><li> Lorsque les cellules sont de 95 - 100% de confluence, les infecter à un (MOI) de 5-10. Pour ce faire, inoculer chaque plaque en utilisant stock de virus dans un volume total de 4 ml par plaque, puis incuber les p...

<ol>
	<li>Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+variability+in+clinical+and+laboratory+isolates+of+herpes+simplex+virus+1+reveals+new+mutations.">Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations.</a> J Virol. 84, 5303-5313 (2010).</li><li>Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+pseudorabies+virus+strains+expressing+red+fluorescent+proteins:+new+tools+for+multisynaptic+labeling+applications.">Development of pseudorabies virus strains expressing red fluorescent proteins: new tools for multisynaptic labeling applications.</a> J Virol. 77, 10106-10112 (2003).</li><li>Kobiler, O., Lipman, Y., Therkelsen, K., Daubechies, I., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpesviruses+carrying+a+Brainbow+cassette+reveal+replication+and+expression+of+limited+numbers+of+incoming+genomes.">Herpesviruses carrying a Brainbow cassette reveal replication and expression of limited numbers of incoming genomes.</a> Nat Commun. 1, 146-146 (2010).</li><li>Enquist, L. W., Madden, M. J., Schiop-Stanley, P., Vande Woude, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+herpes+simplex+type+1+DNA+fragments+in+a+bacteriophage+lambda+vector.">Cloning of herpes simplex type 1 DNA fragments in a bacteriophage lambda vector.</a> Science. 203, 541-544 (1979).</li><li>Smith, G. A., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+transposon+mutagenesis+in+Escherichia+coli+of+a+full-length+infectious+clone+of+pseudorabies+virus,+an+alphaherpesvirus.">Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus.</a> J Virol. 73, 6405-6414 (1999).</li><li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of virology. , (2008).</li><li>Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+pseudorabies+virus:+impact+on+neurovirology+and+veterinary+medicine.">Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 69, 462-500 (2005).</li><li>Roizman, B., Pellett, P. E., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields Virology. , 2381-2397 (2001).</li><li>Mendez, I. I., Hermann, L. L., Hazelton, P. R., Coombs, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+analysis+of+freon+substitutes+in+the+purification+of+reovirus+and+calicivirus.">A comparative analysis of freon substitutes in the purification of reovirus and calicivirus.</a> J Virol Methods. 90, 59-67 (2000).</li><li>Gharabaghi, F., Aymard, M., Trotemann, P., Gerdil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+simplified+micromethod+for+subtyping+varicella-zoster+virus.">A rapid and simplified micromethod for subtyping varicella-zoster virus.</a> J Med Virol. 31, 129-134 (1990).</li><li>Granstedt, A. E., Szpara, M. L., Kuhn, B., Wang, S. S., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+monitoring+of+in+vivo+neural+activity+using+a+circuit-tracing+pseudorabies+virus.">Fluorescence-based monitoring of in vivo neural activity using a circuit-tracing pseudorabies virus.</a> PLoS One. 4, e6923-e6923 (2009).</li></ol>

Certaines parties de ce protocole ont été initialement développées pour l&#39;isolement d&#39;ADN viral dans des conditions de biosécurité L4, mais elle s&#39;adapte aussi bien aux non-BSL conditions. 4 Nous communément utiliser ce protocole pour isoler l&#39;ADN du PRV alpha-herpèsvirus et le HSV-1, qui possèdent des génomes d&#39;ADN enfermé dans une capside protéique et entouré par une enveloppe lipidique. 7,8 Cependant, il est probable directement adaptable à d&#39;autres virus à...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Fréon (1,1,2-trichloro-1 ,2,2-trifluoroéthane) </td><td> Pêcheur </td><td> T178-4 </td><td> Vérifiez auprès de votre institution pour les directives concernant l&#39;élimination appropriée des déchets contenant du fréon, ou de voir Mendez et al. des solutions de rechange potentielles Fréon 9. </td></tr><tr><td> Tubes à verrouillage de phase gel, lourd capacité 15ml </td><td> 5 PRIME </td><td> 2302850 </td><td> En option </td></tr><tr><td> Tubes ultracentrifugation polyallomère </td><td> Beckman * </td><td> 331372 * </td><td> * Sélectionnez tubes appropriés pour votre propre ultracentrifugeuse; ceux-ci sont inclus à titre d&#39;exemple </td></tr><tr><td> NP-40 / IGEPAL </td><td> Sigma </td><td> Je-3021 </td><td></td></tr><tr><td> Cellules PK-15 </td><td> ATCC </td><td> CCL-33 </td><td></td></tr><tr><td> Les cellules Vero </td><td> ATCC </td><td> CCL-81 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> HyClone </td><td> SH30028.03 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of viral dna from nucleocapsids

Les virus sont des parasites cellulaires, et donc l&#39;étude de leur ADN nécessite un matériau isolant virale loin de contaminants de la cellule hôte et de l&#39;ADN. Plusieurs applications en aval nécessitent de grandes quantités d&#39;ADN viral pur, qui est prévue par le présent protocole. Ces applications comprennent le séquençage du génome viral, où la suppression de l&#39;ADN hôte est cruciale pour optimiser la production de données pour les séquences virales, et la production de nouvelles souches virales recombinantes, où la co-transfection de plasmide purifié et linéaire d&#39;ADN viral facilite la recombinaison. 1,2, 3 Cette procédure utilise une combinaison d&#39;extractions et de densité à base de centrifugation afin d&#39;isoler l&#39;ADN purifié herpèsvirus linéaire nucléocapside à partir de cellules infectées. 4,5 Les premières étapes de purification pour but d&#39;isoler capsides virales purifiées, qui contient et protège l&#39;ADN viral au cours de l&#39;extraction et les étapes de centrifugation qui éliminent les protéines cellulaires et l&#39;ADN. Lyse des nucleocapsides libère alors l&#39;ADN viral, et deux finales de phénol-chloroforme étapes éliminer les protéines restantes. L&#39;ADN capturé finale de la solution est très concentré et pur, avec une moyenne DO 260/280 de 1,90. En fonction de la quantité de cellules infectées utilisées, les rendements de l&#39;ADN viral gamme de 150 à 800 mg ou plus. La pureté de cet ADN, il est stable pendant un stockage prolongé à 4 ° C. Cet ADN est donc parfaitement adapté pour séquençage à haut débit, haute fidélité réactions PCR, et transfections. Avant de commencer le protocole, il est important de connaître le nombre moyen de cellules par boîte (par exemple, une moyenne de 8 x 10 6 cellules PK-15 confluentes dans un plat de 15 cm), et le titre du stock viral à utiliser ( par exemple 1 x 10 8 unités formant des plages par ml). Ceux-ci sont nécessaires pour calculer la multiplicité appropriée d&#39;infection (MOI) pour le protocole. 6 Par exemple, pour infecter une de 15 cm plat de cellules PK-15 avec le stock au-dessus virale, àune MOI de 5, vous pouvez utiliser 400 ul de stock viral et le diluer avec 3,6 ml de milieu (volume inoculation total de 4 ml pour une plaque de 15 cm). Plusieurs préparations d&#39;ADN viraux peuvent être préparés en même temps. Le nombre de préparations simultanées n&#39;est limité que par le nombre de tubes détenus par le rotor ultracentrifugeuse (un par le virus; voir l&#39;étape 3.9 ci-dessous). Nous décrivons ici la procédure comme si elle était faite pour un virus.

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Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Nous décrivons le processus d&#39;isolation de haute pureté nucléocapside herpèsvirus ADN à partir de cellules infectées. L&#39;ADN capturé finale de la solution est de forte concentration et de pureté, qui le rend idéal pour séquençage à haut débit, haute fidélité réactions PCR, et transfections pour produire de nouveaux virus recombinants.

Préparation de l&#39;ADN viral à partir des nucléocapsides

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Research

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Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

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Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Recherche

Immunologie et infection

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The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

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