Name: preparation of viral dna from nucleocapsids
Uploaded: 2011-08-16T12:00:00
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Os autores agradecem as contribuições de Greg Smith, Pomeranz Lisa, Matt Lyman, Eldridge Marlies, Staniszewska Halina Goraczniak, e os membros do laboratório Enquist in fine-tuning protocolo isso.

1. Dia primeiro: Infecção viral e Preparação de Buffers <ol><li> Preparar pratos 50-10 (15 cm de diâmetro) de células de cultura de tecidos para a infecção, por exemplo, PK-15 células por vírus pseudo-raiva (PRV) ou células Vero para o vírus herpes simplex (HSV). </li><li> Quando as células são 95 - confluentes 100%, infectá-los em um (MOI) de 10/05. Para fazer isso, inocular cada placa usando o estoque de vírus em um volume total de 4 ml por placa, em seguida, incubar as placas por 1 hora a 37 ° C. P...

<ol>
	<li>Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+variability+in+clinical+and+laboratory+isolates+of+herpes+simplex+virus+1+reveals+new+mutations.">Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations.</a> J Virol. 84, 5303-5313 (2010).</li><li>Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+pseudorabies+virus+strains+expressing+red+fluorescent+proteins:+new+tools+for+multisynaptic+labeling+applications.">Development of pseudorabies virus strains expressing red fluorescent proteins: new tools for multisynaptic labeling applications.</a> J Virol. 77, 10106-10112 (2003).</li><li>Kobiler, O., Lipman, Y., Therkelsen, K., Daubechies, I., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpesviruses+carrying+a+Brainbow+cassette+reveal+replication+and+expression+of+limited+numbers+of+incoming+genomes.">Herpesviruses carrying a Brainbow cassette reveal replication and expression of limited numbers of incoming genomes.</a> Nat Commun. 1, 146-146 (2010).</li><li>Enquist, L. W., Madden, M. J., Schiop-Stanley, P., Vande Woude, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+herpes+simplex+type+1+DNA+fragments+in+a+bacteriophage+lambda+vector.">Cloning of herpes simplex type 1 DNA fragments in a bacteriophage lambda vector.</a> Science. 203, 541-544 (1979).</li><li>Smith, G. A., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+transposon+mutagenesis+in+Escherichia+coli+of+a+full-length+infectious+clone+of+pseudorabies+virus,+an+alphaherpesvirus.">Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus.</a> J Virol. 73, 6405-6414 (1999).</li><li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of virology. , (2008).</li><li>Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+pseudorabies+virus:+impact+on+neurovirology+and+veterinary+medicine.">Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 69, 462-500 (2005).</li><li>Roizman, B., Pellett, P. E., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields Virology. , 2381-2397 (2001).</li><li>Mendez, I. I., Hermann, L. L., Hazelton, P. R., Coombs, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+analysis+of+freon+substitutes+in+the+purification+of+reovirus+and+calicivirus.">A comparative analysis of freon substitutes in the purification of reovirus and calicivirus.</a> J Virol Methods. 90, 59-67 (2000).</li><li>Gharabaghi, F., Aymard, M., Trotemann, P., Gerdil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+simplified+micromethod+for+subtyping+varicella-zoster+virus.">A rapid and simplified micromethod for subtyping varicella-zoster virus.</a> J Med Virol. 31, 129-134 (1990).</li><li>Granstedt, A. E., Szpara, M. L., Kuhn, B., Wang, S. S., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+monitoring+of+in+vivo+neural+activity+using+a+circuit-tracing+pseudorabies+virus.">Fluorescence-based monitoring of in vivo neural activity using a circuit-tracing pseudorabies virus.</a> PLoS One. 4, e6923-e6923 (2009).</li></ol>

Partes deste protocolo foram originalmente desenvolvidos para o isolamento do DNA viral no BSL4 condições, mas adapta-se igualmente bem a não-BSL condições. 4 Nós geralmente usam este protocolo para isolar o DNA do PRV alfa-herpesvírus e HSV-1, que têm genomas de DNA fechado em um capsídeo protéico e cercado por um envelope lipídico. 7,8 No entanto, é provável diretamente adaptável a outros vírus DNA de grande porte, incluindo beta-e gama-herpesvírus e adenovírus. Extrações semel...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Freon (1,1,2-tricloro-1 ,2,2-trifluoroetano) </td><td> Pescador </td><td> T178-4 </td><td> Verifique com sua instituição, para obter orientações sobre o descarte adequado de resíduos contendo Freon, ou ver Mendez et al. de alternativas Freon potencial 9. </td></tr><tr><td> Bloqueio fase de tubos de gel, capacidade de 15ml Pesada </td><td> 5 PRIME </td><td> 2302850 </td><td> Opcional </td></tr><tr><td> Ultracentrífuga tubos Polyallomer </td><td> Beckman * </td><td> 331372 * </td><td> * Selecione tubos apropriados para o seu próprio ultracentrífuga, que são incluídas apenas como exemplo </td></tr><tr><td> NP-40 / IGEPAL </td><td> Sigma </td><td> I-3021 </td><td></td></tr><tr><td> PK-15 células </td><td> ATCC </td><td> CCL-33 </td><td></td></tr><tr><td> Células Vero </td><td> ATCC </td><td> CCL-81 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> HyClone </td><td> SH30028.03 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of viral dna from nucleocapsids

Vírus são parasitas obrigatórios do interior celular e, assim, o estudo do seu DNA requer material isolante viral longe de contaminantes da célula hospedeira e DNA. Várias aplicações a jusante exigem grandes quantidades de DNA viral puro, que é fornecido por este protocolo. Estas aplicações incluem o seqüenciamento do genoma viral, onde a remoção do DNA do hospedeiro é fundamental para otimizar a saída de dados para seqüências virais, ea produção de novas linhagens recombinantes viral, onde co-transfecção de plasmídeos purificados e DNA viral linear facilita a recombinação. 1,2, 3 Este procedimento utiliza uma combinação de extrações e densidade baseado centrifugação para isolar DNA purificado herpesvirus linear nucleocapsídeo das células infectadas. 4,5 As etapas de purificação inicial visam isolar purificada capsídeos virais, que contêm e protegem o DNA viral durante a extração e as etapas de centrifugação que removem as proteínas celulares e DNA. Lise de nucleocapsids então libera DNA viral, e duas finais fenol-clorofórmio passos eliminar as proteínas restantes. O DNA final capturada a partir de solução é altamente concentrada e pura, com uma média de 260/280 OD de 1,90. Dependendo da quantidade de células infectadas utilizado, os rendimentos da faixa DNA viral 150-800 mg ou mais. A pureza deste DNA torna-se estável durante armazenamento a longo prazo em 4C. Este DNA é, portanto, ideal para high-throughput seqüenciamento de alta fidelidade reações PCR e transfections. Antes de iniciar o protocolo, é importante saber o número médio de células por prato (por exemplo, uma média de 8 x 10 6 células PK-15 em um prato centímetros confluentes 15), eo título do estoque viral a ser usado ( por exemplo, 1 x 10 8 unidades formadoras de placas por ml). Estes são necessários para calcular a multiplicidade adequada de infecção (MOI) para o protocolo. 6 Por exemplo, para infectar um prato de 15 cm de PK-15 células com o estoque acima viral, em um MOI de 5, você usaria 400 mL de ações virais e diluir com 3,6 ml de meio (volume de inoculação total de 4 ml para uma placa de 15 cm). Várias preparações de DNA viral podem ser preparados ao mesmo tempo. O número de preparações simultâneas é limitado apenas pelo número de tubos de posse do rotor ultracentrífuga (um por vírus; veja o passo 3.9). Aqui nós descrevemos o procedimento de como se está sendo feito por um vírus.

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Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Descrevemos o processo de isolamento de DNA de alta pureza herpesvirus nucleocapsídeo das células infectadas. O DNA final capturada a partir de solução é de alta concentração e pureza, tornando-a ideal para high-throughput seqüenciamento de alta fidelidade reações PCR e transfections para produzir novos recombinantes viral.

Preparação de DNA viral a partir nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Geração de recombinante do vírus Influenza de DNA plasmidial

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Imunologia e Infecção

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Usando um ensaio Microarray Pan-Viral (Virochip) para Tela de amostras clínicas para patógenos virais

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Isolamento de variantes de vírus de RNA Fidelity e Caracterização de frequência de mutação de vírus

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Separação de Single-stranded DNA, Double-stranded DNA e RNA de uma Comunidade Ambiental Viral Usando Cromatografia hidroxiapatita

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

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Um Protocolo de Chelex simples para extração de DNA de<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

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Estabelecer uma cultura líquida, coberta de vias respiratórias humanas epiteliais Polarized Calu-3 células para estudar a resposta Cell Host para patógenos respiratórios<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

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Estabelecimento de um<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema para estudar o comportamento intracelular de<em&gt; Candida glabrata</em&gt; Em humanos THP-1 macrófagos

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

Calculando a média de Viral glicoproteína do envelope Spikes de Electron Cryotomography reconstruções com Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

Isolamento de Frações Sub-nuclear Viral Replication Compartimento enriquecidas de Adenovirus-infectados células normais Humanos

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The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

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O Desenvolvimento da liofilizado Loop-mediadas isotérmicas de amplificação Reagentes para a detecção de<em&gt; Burnetii Coxiella</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...