Name: preparation of viral dna from nucleocapsids
Uploaded: 2011-08-16T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids at JoVE.com

Авторы ценят вклад Грег Смит, Лиза Померанц, Мэтт Лиман, Марлиз Элдридж, Галина Staniszewska Goraczniak, и члены лаборатории Enquist в тонкой настройки этого протокола.

1. Первый день: Вирусные инфекции и подготовка Буферы <ol><li> Подготовка 5-10 блюд (15 см в диаметре) из тканевой культуры клеток для инфекции, например, PK-15 ячеек для псевдобешенства вируса (PRV) или Vero клеток для вируса простого герпеса (ВПГ). </li><li> Когда клетки на 95 - 100% сливающийся, заразить их (...

<ol>
	<li>Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+variability+in+clinical+and+laboratory+isolates+of+herpes+simplex+virus+1+reveals+new+mutations.">Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations.</a> J Virol. 84, 5303-5313 (2010).</li><li>Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+pseudorabies+virus+strains+expressing+red+fluorescent+proteins:+new+tools+for+multisynaptic+labeling+applications.">Development of pseudorabies virus strains expressing red fluorescent proteins: new tools for multisynaptic labeling applications.</a> J Virol. 77, 10106-10112 (2003).</li><li>Kobiler, O., Lipman, Y., Therkelsen, K., Daubechies, I., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpesviruses+carrying+a+Brainbow+cassette+reveal+replication+and+expression+of+limited+numbers+of+incoming+genomes.">Herpesviruses carrying a Brainbow cassette reveal replication and expression of limited numbers of incoming genomes.</a> Nat Commun. 1, 146-146 (2010).</li><li>Enquist, L. W., Madden, M. J., Schiop-Stanley, P., Vande Woude, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+herpes+simplex+type+1+DNA+fragments+in+a+bacteriophage+lambda+vector.">Cloning of herpes simplex type 1 DNA fragments in a bacteriophage lambda vector.</a> Science. 203, 541-544 (1979).</li><li>Smith, G. A., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+transposon+mutagenesis+in+Escherichia+coli+of+a+full-length+infectious+clone+of+pseudorabies+virus,+an+alphaherpesvirus.">Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus.</a> J Virol. 73, 6405-6414 (1999).</li><li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of virology. , (2008).</li><li>Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+pseudorabies+virus:+impact+on+neurovirology+and+veterinary+medicine.">Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 69, 462-500 (2005).</li><li>Roizman, B., Pellett, P. E., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields Virology. , 2381-2397 (2001).</li><li>Mendez, I. I., Hermann, L. L., Hazelton, P. R., Coombs, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+analysis+of+freon+substitutes+in+the+purification+of+reovirus+and+calicivirus.">A comparative analysis of freon substitutes in the purification of reovirus and calicivirus.</a> J Virol Methods. 90, 59-67 (2000).</li><li>Gharabaghi, F., Aymard, M., Trotemann, P., Gerdil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+simplified+micromethod+for+subtyping+varicella-zoster+virus.">A rapid and simplified micromethod for subtyping varicella-zoster virus.</a> J Med Virol. 31, 129-134 (1990).</li><li>Granstedt, A. E., Szpara, M. L., Kuhn, B., Wang, S. S., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+monitoring+of+in+vivo+neural+activity+using+a+circuit-tracing+pseudorabies+virus.">Fluorescence-based monitoring of in vivo neural activity using a circuit-tracing pseudorabies virus.</a> PLoS One. 4, e6923-e6923 (2009).</li></ol>

Части этого протокола первоначально были разработаны для выделения вируса в ДНК BSL4 условиях, но он одинаково хорошо адаптируется к не-BSL условиях. 4 Мы часто используют этот протокол, чтобы изолировать ДНК из альфа-PRV герпеса и ВПГ-1, которые имеют ДНК геномов заключен в белковый ка?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер в каталоге </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> Фреон (1,1,2-трихлор-1 ,2,2-трифторэтана) </td><td> Рыболов </td><td> T178-4 </td><td> Проверьте с вашим учреждением для руководства по надлежащей утилизации фреона-содержащих отходов, или увидеть, Мендес и соавт. для потенциальных альтернатив фреона 9. </td></tr><tr><td> Фазы блокировки геля труб, тяжелая емкость 15 мл </td><td> 5 премьер </td><td> 2302850 </td><td> Необязательный </td></tr><tr><td> Трубы Polyallomer ультрацентрифуге </td><td> Бекман * </td><td> 331372 * </td><td> * Выберите трубы подходят для вашего собственного ультрацентрифуге; они включены только в качестве примера </td></tr><tr><td> NP-40 / Igepal </td><td> Сигма </td><td> Я-3021 </td><td></td></tr><tr><td> PK-15 клетки </td><td> АТСС </td><td> CCL-33 </td><td></td></tr><tr><td> Vero клетках </td><td> АТСС </td><td> CCL-81 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30028.03 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of viral dna from nucleocapsids

Вирусы являются облигатными паразитами сотовой, и, следовательно, изучение их ДНК требует выделения вирусного материала от клетки-хозяина загрязняющих веществ и ДНК. Несколько ниже по течению приложения требуют большого количества чистой вирусной ДНК, которая предоставляется этим протоколом. Эти приложения включают вирусные секвенирования генома, где удаление ДНК хозяина имеет решающее значение для оптимизации вывода данных вирусных последовательностей и производства новых вирусных рекомбинантных штаммов, где котрансфекцию очищенной плазмиды и линейных вирусной ДНК способствует рекомбинации. 1,2, 3 Эта процедура использует сочетание экстракции и плотности основе центрифугирования, чтобы изолировать очищенный линейный герпеса нуклеокапсида ДНК зараженных клеток. 4,5 начальной стадии очистки целью изолировать очищенной вирусной капсиды, которые содержат и защищают вирусной ДНК во время экстракции и центрифугирования шаги , которые удаляют клеточных белков и ДНК. Лизис нуклеокапсидов затем освобождает вирусной ДНК, и два последних фенол-хлороформ шаги удалить остатки белков. Окончательный ДНК захватили из раствора является высоко концентрированным и чистый, со средним диаметром 260/280 от 1.90. В зависимости от количества инфицированных клеток использовали, дает вирусных ДНК из диапазона 150-800 мкг и более. Чистоту этого ДНК делает ее стабильной в течение длительного хранения при 4С. Эта ДНК, таким образом, идеально подходит для высокой пропускной последовательности, высокая точность ПЦР-реакции, и трансфекции. До начала протокола, важно знать среднее число клеток на блюдо (например, в среднем на 8 х 10 6 PK-15 клеток в сливной 15 см блюдо), и титр вирусной акции, которые будут использоваться ( например, 1 х 10 8 бляшкообразующих единиц на мл). Они необходимы для расчета соответствующей множественности заражения (МВД) для протокола. 6 Например, чтобы заразить 15 см блюдо PK-15 ячеек с выше вирусная акция, в МВД 5, вы должны использовать 400 мкл вирусные акции и развести его с 3,6 мл среды (общий объем инокуляции 4 мл для одного 15 см пластины). Несколько вирусных препаратов ДНК может быть подготовлен в то же время. Количество одновременных препаратов ограничено только количество трубок проводимых ультрацентрифуге ротора (по одному на вирус, см. шаг 3,9 ниже). Здесь мы опишем процедуру, как будто делается для одного вируса.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids at JoVE.com

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Мы опишем процесс выделения высокой чистоты герпеса нуклеокапсида ДНК зараженных клеток. Окончательный ДНК захватили из раствора с высокой концентрацией и чистоты, что делает его идеально подходит для высокой пропускной последовательности, высокая точность ПЦР-реакции, и трансфекции производить новые вирусные рекомбинантов.

Подготовка вирусных ДНК из нуклеокапсидов

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Генерация рекомбинантного вируса гриппа от ДНК плазмиды

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Использование Пан-Вирусные Microarray анализ (Virochip), чтобы экран клинических образцов для вирусных патогенов

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Выделение вариантов Fidelity РНК-содержащих вирусов и характеристика вирусов Частота мутаций

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Разделение одноцепочечных ДНК двухцепочечной ДНК и РНК из экологического сообщества Вирусный Использование гидроксиапатита хроматографии

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Простой протокол Chelex для выделения ДНК из<em&gt; Anopheles</em&gt; SPP.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Создание жидкого покрытые культуры поляризованный человека эпителия дыхательных путей Calu-3 ячейки по изучению клетки-хозяина в ответ на возбудителей инфекций дыхательных путей<em&gt; В пробирке</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Создание<em&gt; В пробирке</em&gt; Система по изучению внутриклеточных Поведение<em&gt; Candida glabrata</em&gt; В человека ТНР-1 макрофагов

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

Усреднение вирусного гликопротеина оболочки Шипы от Electron Cryotomography реконструкциями с помощью Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

Выделение вирусной репликации отсек обогащенных субъядерных фракций из аденовируса-инфицированных клетках человека нормальный

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Развитие Лиофилизированный Loop опосредованных изотермических реагенты для амплификации для обнаружения<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...