Name: preparation of viral dna from nucleocapsids
Uploaded: 2011-08-16T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids at JoVE.com

Författarna uppskattar bidragen från Greg Smith, Lisa Pomeranz, Matt Lyman, Marlies Eldridge, Halina Staniszewska Goraczniak, och medlemmar av Enquist lab i finjusterande detta protokoll.

1. Första dag: virusinfektion och Beredning av buffertar <ol><li> Förbered 5-10 rätter (15 cm diameter) av celler vävnadskultur för infektion, exempelvis PK-15 celler för pseudorabies-virus (PRV) eller Vero celler för herpes simplex virus (HSV). </li><li> När celler är 95 - 100% konfluenta, infekterar dem på en (MOI) på 5-10. För att göra detta, inokulera varje platta med hjälp av viruset lager i en total volym på 4 ml per platta, då Inkubera plattorna under 1 timme vid 37 ° C. Rock plattor försiktig...

<ol>
	<li>Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+variability+in+clinical+and+laboratory+isolates+of+herpes+simplex+virus+1+reveals+new+mutations.">Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations.</a> J Virol. 84, 5303-5313 (2010).</li><li>Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+pseudorabies+virus+strains+expressing+red+fluorescent+proteins:+new+tools+for+multisynaptic+labeling+applications.">Development of pseudorabies virus strains expressing red fluorescent proteins: new tools for multisynaptic labeling applications.</a> J Virol. 77, 10106-10112 (2003).</li><li>Kobiler, O., Lipman, Y., Therkelsen, K., Daubechies, I., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpesviruses+carrying+a+Brainbow+cassette+reveal+replication+and+expression+of+limited+numbers+of+incoming+genomes.">Herpesviruses carrying a Brainbow cassette reveal replication and expression of limited numbers of incoming genomes.</a> Nat Commun. 1, 146-146 (2010).</li><li>Enquist, L. W., Madden, M. J., Schiop-Stanley, P., Vande Woude, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+herpes+simplex+type+1+DNA+fragments+in+a+bacteriophage+lambda+vector.">Cloning of herpes simplex type 1 DNA fragments in a bacteriophage lambda vector.</a> Science. 203, 541-544 (1979).</li><li>Smith, G. A., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+transposon+mutagenesis+in+Escherichia+coli+of+a+full-length+infectious+clone+of+pseudorabies+virus,+an+alphaherpesvirus.">Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus.</a> J Virol. 73, 6405-6414 (1999).</li><li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of virology. , (2008).</li><li>Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+pseudorabies+virus:+impact+on+neurovirology+and+veterinary+medicine.">Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 69, 462-500 (2005).</li><li>Roizman, B., Pellett, P. E., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields Virology. , 2381-2397 (2001).</li><li>Mendez, I. I., Hermann, L. L., Hazelton, P. R., Coombs, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+analysis+of+freon+substitutes+in+the+purification+of+reovirus+and+calicivirus.">A comparative analysis of freon substitutes in the purification of reovirus and calicivirus.</a> J Virol Methods. 90, 59-67 (2000).</li><li>Gharabaghi, F., Aymard, M., Trotemann, P., Gerdil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+simplified+micromethod+for+subtyping+varicella-zoster+virus.">A rapid and simplified micromethod for subtyping varicella-zoster virus.</a> J Med Virol. 31, 129-134 (1990).</li><li>Granstedt, A. E., Szpara, M. L., Kuhn, B., Wang, S. S., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+monitoring+of+in+vivo+neural+activity+using+a+circuit-tracing+pseudorabies+virus.">Fluorescence-based monitoring of in vivo neural activity using a circuit-tracing pseudorabies virus.</a> PLoS One. 4, e6923-e6923 (2009).</li></ol>

Delar av detta protokoll utvecklades ursprungligen för viralt DNA isolering i BSL4 förhållanden, men den anpassar lika bra för icke-BSL villkor. 4 Vi brukar använda det här protokollet för att isolera DNA från alfa-herpesvirus PRV och HSV-1, som har DNA-genomet inneslutna i ett proteinhaltig kapsid och omgiven av en lipid kuvert. 7,8 Det är dock sannolikt direkt kan anpassas till andra stora DNA-virus, inklusive beta-och gamma-herpesvirus och adenovirus. Liknande extraktioner används ofta...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namn på reagens </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Freon (1,1,2-triklor-1 ,2,2-trifluoretan) </td><td> Fisher </td><td> T178-4 </td><td> Kontrollera med din institution för riktlinjer avseende lämpligt omhändertagande av freon avfall som innehåller, eller se Mendez et al. för potentiella freon alternativ. 9 </td></tr><tr><td> Fas lås gel tuber, Heavy 15ml kapacitet </td><td> 5 PRIME </td><td> 2302850 </td><td> Tillval </td></tr><tr><td> Polyallomer ultracentrifugen rör </td><td> Beckman * </td><td> 331.372 * </td><td> * Välj rören lämpliga för din egen ultracentrifugen, dessa ingår som ett exempel </td></tr><tr><td> NP-40 / IGEPAL </td><td> Sigma </td><td> Jag-3021 </td><td></td></tr><tr><td> PK-15 celler </td><td> ATCC </td><td> CCL-33 </td><td></td></tr><tr><td> Vero-celler </td><td> ATCC </td><td> CCL-81 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> HyClone </td><td> SH30028.03 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of viral dna from nucleocapsids

Virus är obligata cellulära parasiter, och därmed att studera deras DNA kräver att isolera virus material från värdcellen föroreningar och DNA. Flera nedströms tillämpningar kräver stora mängder ren virus-DNA, som tillhandahålls genom detta protokoll. Dessa applikationer inkluderar virusgenom sekvensering, där avlägsnande av värd-DNA är avgörande för att optimera utdata för viral sekvenser, och produktionen av nya virus rekombinanta stammar, där samarbetet transfektion av renat plasmiden och linjär viralt DNA underlättar rekombination. 1,2, 3 Detta förfarande använder en kombination av extraktioner och täthet-baserade centrifugering för att isolera renas linjär herpesvirus nukleokapsid DNA från infekterade celler. 4,5 Den inledande reningssteg syftar till att isolera renat virus capsids, som innehåller och skyddar den virala DNA under extraktioner och steg centrifugering som tar bort cellulära proteiner och DNA. Lys av nucleocapsids släpper sedan viralt DNA, och två sista fenol-kloroform steg bort återstående proteiner. Den slutliga DNA fångas från Lösningen är mycket koncentrerad och ren, med en genomsnittlig OD 260/280 på 1,90. Beroende på mängden infekterade används celler, ger av virus-DNA intervallet 150 till 800 mikrogram eller mer. Renheten av detta DNA gör den stabil under långvarig förvaring vid 4C. Detta DNA är därför idealisk för hög genomströmning sekvensering, high fidelity PCR reaktioner och transfections. Före början protokollet är det viktigt att veta det genomsnittliga antalet celler per fat (t.ex. i genomsnitt 8 x 10 6 PK-15 celler i ett sammanhängande 15 cm fat), och titer av virala materiel som skall användas ( t.ex. 1 x 10 8 plaque-forming enheter per ml). Dessa är nödvändiga för att räkna ut rätt mängd av infektion (MOI) för protokollet. 6 Till exempel för att infektera en 15 cm parabolantenn i PK-15 celler med ovanstående virus beståndet, i ett MOI av 5, vill du använda 400 ìl virala lager och späd den med 3,6 ml medium (totalt ympning volym på 4 ml för en 15 cm platta). Flera viralt DNA preparat kan vara beredd på samma gång. Antalet samtidiga förberedelserna begränsas bara av antalet rör som innehas av ultracentrifugen rotorn (en per-virus, se steg 3,9 nedan). Här beskriver vi proceduren som om görs för ett virus.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids at JoVE.com

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Vi beskriver processen att isolera hög renhet herpesvirus nukleokapsid DNA från infekterade celler. Den slutliga DNA fångas från lösning med hög koncentration och renhet, vilket gör den idealisk för hög genomströmning sekvensering, high fidelity PCR reaktioner och transfections att producera nya virus rekombinanter.

Beredning av viral DNA från Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Generering av Rekombinant influensavirus från Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Med hjälp av en Pan-Viral microarray analys (Virochip) till skärm kliniska prover för virala patogener

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Isolering av Fidelity Varianter av RNA-virus och karakterisering av virus mutationsfrekvensen

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Separation av enda DNA, dubbel-strängat DNA och RNA ur miljösynpunkt Viral gemenskapen med hjälp av hydroxyapatit Kromatografi

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

En enkel Chelex protokoll för DNA-extraktion från<em&gt; Anopheles</em&gt; SPP.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Att upprätta en flytande täckt kultur av polariserad Human luftvägsepitelceller Calu-3 celler för att studera svar värdcellen för luftvägspatogener<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Inrättande av en<em&gt; In vitro</em&gt; System för att studera intracellulära Beteende<em&gt; Candida glabrata</em&gt; I Human THP-1 makrofager

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

Medelvärdes av Viral höljesglykoproteinet Spikes från Electron Cryotomography rekonstruktioner använder Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

Isolering av Viral Replication Fack-berikade underkärn Fraktioner från adenovirus-infekterade Normal humana celler

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Utvecklingen av lyofiliserad Loop-medie Isothermal amplifieringsreagenserna för detektion av<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...