Name: cryopreservation of mouse embryos by ethylene glycol-based vitrification
Uploaded: 2011-11-18T12:00:00
Duration: 6 min
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Este estudo foi realizado em cooperação com o Projeto Bioresource Nacional, o Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia, do Japão.

O esquema geral do experimento é mostrado na figura. 1. 1. Preparação do Reagente <ol><li> Tornar o meio de base (aqui no conhecido como PB1), em uma garrafa de vidro de 100 ml de acordo com o gráfico abaixo: <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> MW </td><td> mM </td><td> mg/100ml </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,4 </td><td> 136,98 </td><td> 800,0 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,6 </td><td> 2,68 </td><td> 20,0 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 136,1 </td><td> 1,47 </td><td> 20,0 </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 0,12 H 2 O </td><td> 358,14 </td><td> 8,04 </td><td> 288,1 </td></tr><tr><td> MgCl 2, 6H 2 O </td><td> 203,3 </td><td> 0,49 </td><td> 10,0 </td></tr><tr><td&gt; Glucose </td><td> 180,2 </td><td> 5,56 </td><td> 100,0 </td></tr><tr><td> Na piruvato </td><td> 110 </td><td> 0,33 </td><td> 3,6 </td></tr><tr><td> CaCl 2, 2H 2 O </td><td> 147 </td><td> 0,9 </td><td> 13,2 </td></tr><tr><td> Penicilina G </td><td></td><td></td><td> 6.0 (aprox) </td></tr></tbody></table></li><li> Fazer o Ficoll-solução de sacarose (FS): <ol><li> Adicionar os seguintes produtos químicos a 14 ml de solução PB1 em um tubo de 50 ml. <table border="1"><tbody><tr><td> Ficoll 70 </td><td> 6,0 g </td></tr><tr><td> Sacarose </td><td> 3,424 g </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 42,0 mg </td></tr></tbody></table></li><li> Mix Ficoll 70 e sacarose em PB1 solução e agitar bem até dissolver completamente. </li><li> Depois de verificar a completa dissolução acima, adicione BSA na superfície da solução e mantê-la4oC até BSA esteja completamente dissolvido (&gt; 4 horas ou durante a noite). </li></ol></li><li> Fazer a solução de equilíbrio (EFS20) ea solução de vitrificação (EFS40) em um tubo de 50 ml: <ul><li> EFS20: 20% (v / v) etilenoglicol, 24% (w / v) Ficoll, sacarose e 0,4 mol / L em PB1 com BSA </li><li> EFS40: 40% (v / v) etilenoglicol, 18% (w / v) Ficoll, e 0,3 mol / L de sacarose * em PB1 com BSA * Para embriões da linhagem BALB / c ou ICR, aumentar a concentração de sacarose a 0,9 sacarose mol / L, pois são mais sensíveis a cryodamage 6. </li></ul><table border="1"><tbody><tr><td></td><td> EFS20 solução </td><td> EFS40 solução </td></tr><tr><td> Etilenoglicol </td><td> 1 ml </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> Solução de FS </td><td> 4 ml </td><td> 3 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Esterilizar a solução por filtração usando um filte 0,45 mMr. Faça alíquotas em 5 tubos de poliestireno ml e armazenar a 4 ° C. Eles podem ser usados ​​por cerca de 6 meses. </li><li> Preparação da solução embrião descongelamento contendo sacarose 0,75 M (TS1) <ol><li> Dissolver 7,7 g de sacarose na PB1 (preparada no passo 1.1) e trazer o volume total de 30 ml. Misturar por agitação suave até sacarose esteja completamente dissolvido. </li><li> Adicionar 90 mg de BSA sobre a superfície da solução e deixá-lo ficar até que esteja completamente dissolvido. </li><li> Esterilizar a solução por filtração. </li><li> Alíquotas e armazenar a 4 ° C. Eles podem ser usados ​​por cerca de 1 mês. </li></ol> Nota: TS1 também podem ser preparados a partir de M2 ​​disponível comercialmente. <ol start="6"><li> Dissolver 7,7 g de sacarose em M2 e trazer o volume total de 30 ml. </li><li> Misturar por agitação suave até sacarose esteja completamente dissolvido. </li><li> Esterilizar a solução por filtração. </li><li> Alíquotas e armazenar a 4oC. Eles podem ser usados ​​por cerca de 1 mês. </li></ol></li><li> Solução TS2 (descongelamentocontendo sacarose 0,25 M): <ol><li> Diluir 10 ml TS1 com 20 ml de PB1 ou M2, conforme o caso. </li><li> Alíquotas e armazenar a 4 ° C. Eles podem ser usados ​​por cerca de 1 mês. </li></ol></li></ol> 2. Vitrificação de embriões de 2 células de rato <ol><li> Prepare duas células de embriões de rato por monta natural ou convencional em técnicas de fertilização in vitro. </li><li> Alíquota de 50 mL em um EFS40 cryotube. Seguir, executar o resto do processo de vitrificação na temperatura ambiente. </li><li> Alíquota de 50 mL de EFS20 no fundo de um de 35 mm ou 60 mm placa de Petri de plástico. </li><li> Transferir até 30 embriões para EFS20 usando um capilar de vidro com apenas a quantidade mínima de meio de cultura. Iniciar um temporizador para 2 min. Nota: os embriões Coloque no fundo da gota. Isso faz com que a desidratação eficiente de embriões. Verificar a morfologia dos embriões por um estereomicroscópio. Embriões desidratados mostram uma morfologia encolhido, como mostrado na figura. 2A.Se eles não são desidratadas o suficiente, espere por mais 1 ou 2 min. </li><li> Em torno de 1,5 min, pegar os embriões a partir da queda EFS20 com apenas a quantidade mínima de solução. Transferi-los para EFS40 na cryotube preparada em 2.1 passo. Nota: Para obter melhores resultados, ajustar o tempo de pegar os embriões, para que todos os embriões podem ser transferidos para EFS40 em torno de 2 min. </li><li> Espere por 1 min. </li><li> Coloque o cryotube diretamente em nitrogênio líquido (LN 2). </li></ol> 3. Descongelar embriões vitrificados duas células-Mouse <ol><li> Antes de descongelar, preparar um prato com 10 gotas mL de meio de cultura de embriões de embriões recuperados (veja o passo 3.13). Cubra o prato com azeite e coloque em uma incubadora de CO 2 até o uso. Nota: Apesar de todos os meios de cultura de embriões de rotina podem ser utilizadas neste experimento, recomendamos mídia com maior osmolaridade, como meio de M16. </li><li> TS1 quente a 37 ° C. </li><li> Coloque em uma máscara facial e cryogloves. Abra a LN 2 tank e recuperar um cryotube contendo embriões. </li><li> Abrir rapidamente o topo do tubo e descartar LN 2. Aguarde 30 segundos para evitar o congelamento a partir de TS1 o próximo passo. </li><li> Use uma pipeta 1000ul para adicionar 850 mL de TS1 (37 ° C) dentro do tubo e misture a solução pipettings suave (cerca de dez vezes em 25 segundos) até que a solução está uniformemente dissolvido. </li><li> Transferência de todo o volume do tubo a uma 60 milímetros de plástico placa de Petri (ou vidro de relógio) (Fig. 3A). Nota: Os embriões devem ser manipulados em temperatura ambiente (22-25 ° C) até que eles são colocados em uma incubadora de CO 2 na Etapa 3.14. </li><li> Iniciar um temporizador para 3 min. </li><li> Em torno de 2 min no TS1, agite levemente o prato até o meio contendo embriões é espalhado sobre a superfície do prato (Fig. 3B). Nota: Isto ajudará os embriões descem até o fundo, porque eles estão flutuando perto da superfície quando transferido para TS1. </li><li> Coloque três gotas de 50 mL de TS2 em diae prato (Fig. 3C). </li><li> Depois de 3 min em TS1, verificar a morfologia de embriões por um estereomicroscópio, que devem ser ligeiramente encolhido. Veja a morfologia de embriões em anteriores (Fig. 2B) e posterior (Fig. 2C) no TS1. Nota: Se os embriões ainda estão inchadas, mantê-los em TS1 por mais 1-3 min. </li><li> Pegar os embriões e transferi-los para a primeira gota de TS2 (Fig. 3D). Iniciar um temporizador para 3 min </li><li> Depois de 3 min, transferência de embriões para a segunda gota e depois para a terceira queda (Fig. 3E). </li><li> Transferência dos embriões para o meio de cultura preparado no Passo 3.1. Os embriões são na forma mostrada na figura. 2D. </li><li> Coloque em um prato de CO 2 incubadora. Cerca de 10 min mais tarde, a transferência de embriões para a próxima gota de meio de cultura para lavar sacarose que foi transitado do TS2. </li><li> Continue cultura em uma incubadora de CO2 até a transferência de embrião. Nota: Embry TransferênciaOS para o oviduto de receptoras no dia da descongelação. Cultura in vitro tempo pode diminuir a viabilidade de embriões em algumas linhagens de camundongos. </li></ol> 4. Resultados representativos: In vitro - e in vivo de embriões desenvolvimento após o descongelamento é apresentado nas Tabelas 1 e 2. As vantagens deste protocolo são a alta capacidade de sobrevivência dos embriões após o descongelamento e sua ampla aplicabilidade para diferentes linhagens de camundongos. <table border="1"><tbody><tr><td> Tensão </td><td> No. total de tubos </td><td> N º de embriões vitrificados </td><td> Recuperado (No. (%)) </td><td> Morfologicamente normais (N º (%)) </td><td> Desenvolvimento de blastocistos (n º (%)) </td></tr><tr><td> C57BL/6J </td><td> 20 </td><td> 400 </td><td> 397 (99) </td><td> 394 (99) </td><td> 342 (87) </td></tr><tr><td> BALB / ca </td><td> 15 </td><td> 300 </td><td> 296 (99) </td><td> 282 (95) </td><td> 238 (84) </td></tr><tr><td> ICR </td><td> 24 </td><td> 480 </td><td> 474 (99) </td><td> 443 (93) </td><td> 398 (90) </td></tr></tbody></table> Tabela 1. In vitro-desenvolvimento de embriões vitrificados e descongelados em linhagens de camundongos comuns <table border="1"><tbody><tr><td> Condição de embriões </td><td> N º de beneficiários do sexo feminino </td><td> N º de embriões transferidos </td><td> Locais de implantação (No. (%)) </td><td> Vivem descendentes (No. (%)) </td></tr><tr><td> Fresco </td><td> 12 </td><td> 180 </td><td> 141 (78.3) </td><td> 110 (61.1) </td></tr><tr><td> Vitrificados </td><td> 16 </td><td> 242 </td><td> 202 (83.5) </td><td> 125 (51.7) </td></tr></tbody></table> Tabela 2. In vivo desenvolvimento de embriões vitrificados e descongelados em camundongos C57BL/6J. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig1.jpg" /> Figura 1. O esquema geral do experimento, incluindo equilíbrio, vitrificação e descongelamento de embriões. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig2.jpg" /> Figura 2. A morfologia de embriões em cada etapa do descongelamento. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig3.jpg" /> Figura 3. Thawing procedimento de embriões. Todos os procedimentos são realizados à temperatura ambiente. (A), Adicionar 850 mL de TS1 (37 ° C) em um cryotube e transferência de todo o volume da solução no cryotube em um prato de plástico. Neste momento, os embriões olhar inchado como mostrado na figura. 2B. (B), espalhe a solução sobre a superfície do prato, agitando suavemente. (C), coloque três gotas de 50 mL de TS2 no prato de plástico. (D), Transferência de embriões para a primeira gota de TS2. Depois de 3 min, os embriões olhar shurunken como mostrado na figura. 2C. (E), transferi-los de sériely no TS2 restantes gotas e depois para o meio de cultura.

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	<li>Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+mouse+embryos+frozen+to+-196&#176;+and+-269&#176;C.">Survival of mouse embryos frozen to -196&#176; and -269&#176;C.</a> Science. 187, 411-414 (1972).</li><li>Rall, W. F., Fahy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-free+cryopreservation+of+mouse+embryos+at+-196&#176;C+by+vitrification.">Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196&#176;C by vitrification.</a> Nature. 313, 573-575 (1985).</li><li>Yoshiki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+resources+at+the+RIKEN+BioResource+center.">The mouse resources at the RIKEN BioResource center.</a> Exp. Anim. 58, 85-96 (2009).</li><li>Mochida, K., Ogura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+embryos+in+laboratory+species.">Cryopreservation of embryos in laboratory species.</a> J. Mamm. Ova. Res. 27, 87-92 (2010).</li><li>Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+mouse+embryos+cryopreservation+in+a+low+toxicity+vitrification+solution,+without+appreciable+loss+of+viability.">A simple method for mouse embryos cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability.</a> J. Reprod. Fert. 89, 91-97 (1990).</li><li>Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genotype+on+the+efficiency+of+mouse+embryo+cryopreservation+by+vitrification+or+slow+freezing+methods.">Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing methods.</a> Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).</li><li>Kasai, M., Mukaida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+animal+and+human+embryos+by+vitrification.">Cryopreservation of animal and human embryos by vitrification.</a> Reprod. Biomed. Online. 9, 164-170 (2004).</li><li>Miyake, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+mouse+oocytes+and+embryos+at+various+stages+of+development+in+an+ethylene+glycol-based+solution+by+a+simple+method.">Vitrification of mouse oocytes and embryos at various stages of development in an ethylene glycol-based solution by a simple method.</a> Theriogenology. 40, 121-134 (1993).</li><li>Han, M. S., Niwa, K., Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+rat+embryos+at+various+developmental+stages.">Vitrification of rat embryos at various developmental stages.</a> Theriogenology. 59, 1851-1863 (2003).</li><li>Jin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibrium+vitrification+of+mouse+embryos.">Equilibrium vitrification of mouse embryos.</a> Biol. Reprod. 82, 444-450 (2010).</li></ol>

Não temos nada a revelar.

Desde o primeiro relato de vitrificação embrião de rato por Rall e Fahy, em 1985, duas, várias melhorias técnicas têm sido feitos para aumentar a capacidade de sobrevivência dos embriões após o descongelamento. Uma das modificações mais bem sucedida foi conseguida através da utilização de etileno glicol como crioprotetor por causa de sua baixa toxicidade e alta permeabilidade da membrana. Tais vantagens permitem-nos lidar com embriões congelamento à temperatura ambiente 4; métodos de vitrificação outras requerem embrião entregando a temperaturas mais frias e nem sempre são aplicáveis ​​a algumas linhagens de camundongos incluindo BALB / c 6. O etileno glicol vitrificação primeiro baseado foi desenvolvido por Kasai et al. em 1990 5,7. Porque o método original foi otimizada para canudos de plástico como recipientes, nós temos um pouco modificou o protocolo para criotubos, que são mais facilmente acessíveis em laboratórios e mais resistentes a danos físicos. Portanto, o método de vitrificação aqui descrito pode ser applicable para muitos laboratórios usando ratos como modelos de pesquisa. O mesmo método também pode ser usado para embriões de camundongos na mórula e blastocisto estágios 8 e 9 embriões de ratos. No entanto, temos encontrado recentemente que a qualidade dos criotubos podem afetar as taxas de sobrevivência dos embriões após o congelamento-descongelamento. Assim, é essencial para examinar a superfície interna do criotubos por sua suavidade antes de embriões vitrificação (por exemplo, ver a Tabela de reagentes e equipamentos específicos). Métodos de vitrificação têm muitas vantagens sobre métodos convencionais de congelamento lento, mas que inerentemente têm uma desvantagem em relação a finalidade de transporte. Como embriões vitrificados deve ser mantida a inferiores a -120 ° C para manter a sua viabilidade, carregadores secos são geralmente utilizados para o seu transporte seguro. Carregadores secos são pesados ​​e volumosos, e sua ida e volta é caro, especialmente para o transporte internacional. Estamos agora a desenvolver um método de vitrificação novoque os embriões vitrificados podem ser armazenados em temperatura de gelo seco (cerca de -80 ° C) durante pelo menos sete dias 10. Este método deve ser a vitrificação da próxima geração.

<table border="1"><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comments (opcional) </td></tr><tr><td> Albumina de soro bovino </td><td> Merck Biosciences (Calbiochem) </td><td> 12657 </td><td></td></tr><tr><td> Etilenoglicol </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 058-00986 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll 70 </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0310-10 </td><td></td></tr><tr><td> Glicose </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 041-00595 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 191-01665 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 163-03545 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 169-04245 </td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 · 12H 2 </sub&gt; O </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 500-04195 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 · 6H 2 O </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 135-00165 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 · 2H2O </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 031-00435 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina G </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-4687 </td><td></td></tr><tr><td> Piruvato de sódio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-8574 </td><td></td></tr><tr><td> Sacarose </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 196-00015 </td><td></td></tr><tr><td> M16 médio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7292 </td><td></td></tr><tr><td> Meio M2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7167 </td><td></td></tr><tr><td> Criotubo </td><td> Sumitomo Bakelite </td><td> MS-4501 </td><td> &quot;Vial criogénicos&quot; </td></tr></table>

cryopreservation of mouse embryos by ethylene glycol-based vitrification

Criopreservação de embriões de camundongos é uma base tecnológica que suporta ciências biomédicas, porque muitas cepas de camundongos foram produzidos por modificações genéticas eo número está aumentando de forma consistente ano após ano. O seu desenvolvimento técnico começou com lentidão métodos de congelação na década de 1970 1, seguido por métodos de vitrificação desenvolvido no final dos anos 1980 2. Geralmente, a última técnica é vantajosa em sua rapidez, simplicidade e alta capacidade de sobrevivência de embriões recuperados. No entanto, o crioprotetores contidas são altamente tóxicos e podem afetar o desenvolvimento embrionário subseqüente. Portanto, a técnica não era aplicável a certas cepas de camundongos, mesmo quando as soluções são refrigerados a 4 ° C para mitigar o efeito tóxico durante a manipulação de embriões. No Bioresource RIKEN Center, mais de 5000 linhagens de camundongos com diferentes backgrounds genéticos e fenótipos são mantidos 3, e, portanto, ter otimizado a te vitrificaçãonão haver descrição prévia com a qual podemos criopreservar embriões de várias espécies diferentes de camundongos, com os benefícios de sobrevivência embrionária após a vitrificação alta e descongelamento (ou liquefação, mais precisamente), à temperatura ambiente 4. Aqui, apresentamos um método de vitrificação para embriões de camundongos que tem sido utilizado com sucesso no nosso centro. A solução de criopreservação contém etileno glicol, em vez de DMSO para minimizar a toxicidade de embriões 5. Ele também contém Ficoll e sacarose para a prevenção de desvitrificação e ajuste osmótico, respectivamente. Embriões podem ser manipulados em temperatura ambiente e transferida em nitrogênio líquido dentro de 5 min. Porque o método original foi otimizada para canudos de plástico como recipientes, nós temos um pouco modificou o protocolo para criotubos, que são mais facilmente acessíveis em laboratórios e mais resistentes a danos físicos. Descrevemos também o processo de descongelamento de embriões vitrificados em detalhes porque é um ste críticap para a recuperação eficiente de camundongos vivos. Estas metodologias seria útil para pesquisadores e técnicos que necessitam de preservação das linhagens de camundongos para uso posterior em uma maneira segura e rentável.

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Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Uma etileno glicol baseado em método de vitrificação para embriões de camundongos é descrito. É vantajoso para outros métodos, em sua simplicidade e toxicidade embrionária baixo e, portanto, pode ser amplamente aplicável a muitas cepas de camundongos, incluindo camundongos isogênicos e gene modificado.

Criopreservação de embriões de camundongos por Vitrificação Etileno Glicol-Based

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