Name: a simple guide screw method for intracranial xenograft studies in mice
Uploaded: 2011-09-26T13:00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Verlene Генри Холмс и Линдсей за помощь в разработке этой модели. Эта работа частично финансировалась Джеймс С. McDonnell Foundation (# 220020173).

1. Клеточные линии <ol><li> U87MG глиомы клетки культивируют в больших тканевых культур колбы с DMEM-F12 с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS). </li><li> Клетки собирали стиральной колбы дважды с теплым фосфатно-солевым буфером (PBS) и инкубации их при 37 ° С в течение 5 минут с 10 мл PBS, содержащем 0,25 трипсина% и 0,05% ЭДТА. Как только клетки поднимаются, они помещаются в 50 мл пробирку, содержащую 10 мл питательной среды и центрифугировали (300 X г в течение 4 мин). </li><li> После мытья, клетки ресуспендировали в концентрации 10 х 10 6 / мл в культуре средств массовой информации, что позволило прививки 50 000 клеток / мкл 5. </li><li> Клетки хранятся на льду до внутричерепных инъекций. </li></ol> 2. Руководство винта внутричерепное болтов Эта процедура может быть проведена за несколько дней до введения клеток. Все процедуры, описанные здесь были проведены под строгим стерильных условиях. <ol><li> Мыши (BALB / с ню / ню женщины; 5-6 недель, и примерно 18 г) пронумерованы в целях идентификации, взвешивают и anesthetised с внутрибрюшинно (IP) инъекция смеси кетамина (100 мг / кг) и ксилазина (5 мг / кг). </li><li> Кожа протирать с раствором йода и маленький разрез (2-3 мм) производится по правой стороне от средней линии и впереди interaural линии. Это подвергает корональной и сагиттальной швов черепа. Брегмы расположена на стыке этих двух швов. </li><li> Вступления руководство винт точка затем отмечено в точке 2,5 мм боковые и 1 мм впереди брегмы. Эта точка находится прямо над хвостатого ядра 1. </li><li> 1 х 1 мм в глубину отверстия сверлят с стерильных ручной поворот просверлить череп оболочки. </li><li> Стерилизовать винт руководство, которое будет распространяться 1,6 мм ниже поверхности черепа в оболочку, затем ринулся в отверстие с помощью отвертки, пока на одном уровне с черепом (рис. 1А). </li><li> Стерильные стилет или винт манекен затем помещается в центральное отверстие направляющей винт, чтобы закрыть отверстие (рис. 1В). </li><li> Рана закрыта с Vetbond клей ткани (н-бутил цианоакрилат) и мышей приведены внутрибрюшинного введения reversine (мелкие животные) (0,1 мл / кг) и carprofen (5 mg/kg/100 мкл) для обезболивания. Мыши затем позволили восстановить на потепление мат (36 ° C), которая может занять до 20 минут. Мыши часто контролируется и наблюдается в течение этого времени на восстановление, пока они не в полном сознании. </li></ol> 3. Внутричерепное сотовой приживления <ol><li> Стерильный шприц манжетами Хэмилтон готовится с применением небольшого кольца до кончика иглы, допуская только 2 мм иглой расширить ниже розетки руководство винт (рис. 1В). Конечная точка прививки, следовательно, 3,5 мм ниже поверхности черепа. </li><li> Через четыре дня после операции винт руководства, мышей снова под наркозом, что и выше (2,1) и небольшой разрез делается над руководство винт для удаления стилет. </li><li> Манжетами шприц Гамильтон затем заполняется 5 мкл и смешанных ячеек принимать меры предосторожности, чтобы не создавать или составлять любые воздушные пузыри. </li><li> Шприц крепится к перфузии насос и игла вводится в винт руководство (рис. 1в). Затем клетки переплетаются в размере 30 мкл в час. </li><li> Автоматизированные аппараты (рис. 1D) позволило нам внедрить до 10 животных одновременно с постоянной скоростью потока. Клетки могут также быть введены вручную с помощью шприца Hamilton манжетами или же шприц можно манжетами по 200 мкл кончика пипетки, которые были сокращены на 3 мм, чтобы кончик иглы выходить за рамки руководства винт на 2 мм. Инъекция должна быть выполнена на постоянном устойчивыми темпами. </li><li> Когда настой будет завершена, шприц, тщательно удалены и заменены стилет в руководстве винт. Рана клееного закрыты и мышей приведены восстановления лекарства как и раньше (2.7) и позволил восстановить на потепление мат. </li></ol> 4. Терапевтические проблемы <ol><li> Через четыре дня после прививки U87MG клетки, мышей взвешивали и случайным образом разделены на контроль и лечение групп. </li><li> Контрольную группу дано внутри-перитонеального (IP), инъекции PBS (100 мкл), в то время как лечение группе задается IP-инъекция AMG102 (100 мкг в 100 мкл PBS). </li><li> Инъекции повторяются каждый второй день в течение 14 дней, всего 6 инъекций (рис. 2). </li><li> После последней инъекции, мышей контролируется на ежедневной основе и весил каждый второй день. </li><li> Когда мыши стали проявлять значительную неврологических нарушений (нарушение баланса, паралич), обезвоживание, или более чем на 10% потери веса или умирающим, они были гуманно euthanised. Эти гуманные конечной точки дней затем были записаны на выживаемости Каплана-Мейера кривой. </li></ol> 5. Оценка терапевтической эффективности </p&gt; <ol><li> Выживаемости Каплана-Мейера кривая была создана с использованием GraphPad Призма 4,03 для Windows; GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США, <a href="http://www.graphpad.com">www.graphpad.com</a> 3. Смертей или euthanizations были отмечены как конечная точка события и забил как 1. Животные, которые остались живы в конце эксперимента были зарегистрированы как не-события и забил как 0. </li></ol> 6. Представитель результаты: Контрольные животные стали проявлять признаки неврологических нарушений и потерю веса 23 дней после первой прививки клеток. Это было значительно задерживается в AMG102 группе терапии до 35 дней. Действительно, по 35-й день, 77% (п = 7 / 9) в контрольной группе были умерщвлены. Выживаемости Каплана-Мейера кривой наглядно демонстрирует значительное увеличение выживаемости в ответ на AMG102 лечения (рис. 3). Днем 70, 88% контрольных мышей были умерщвлены (п = 8 / 9) по сравнению с 37% (п = 3 / 8) из AMG102 группе терапии. Гистологический анализ мозга подтвердило, что все 9 животных в контрольной группе, развились опухоли по сравнению с только 3 из 8 AMG102 мышей (рис. 4). <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig1.jpg" /> Рисунок 1: Image () показывает, внутричерепное винт руководства расположены в районе, расположенном непосредственно над хвостатого ядра. Манжетами Гамильтон шприц (с предустановленной клетки) помещают внутрь руководство винт так, чтобы 2 мм игла выходит за рамки руководства и клетки вводят 3,5 мм внутри хвостатого ядра. Шприц позже удален и заменен стилет (B). Автомат инфузии (C) может внедрить до 10 животных одновременно. Здесь показаны пяти одновременных инъекций (D). <img alt="Рисунок 2" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig2.jpg" /> Рисунок 2: Схема протокола исследования. Клетки вводили в день 0 лечения начиная с 4-й день. Контрольные животные получали инъекции PBS (100 мкл) IP в то время как лечение группа получала инъекции AMG102 (100 μg/100 мкл) IP. Эти инъекции были даны каждый второй день в течение 10 дней. Всего 6 инъекций дали. Животные были тогда мониторинг в течение 70 дней признаки неврологических и физических нарушений. <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig3.jpg" /> Рисунок 3: Каплан-Майера выживания кривой сравнения контроля и AMG102 мышей. Значительные выживания была получена после лечения AMG102 (р = 0,005). <img alt="Рисунок 4" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig4.jpg" /> Рисунок 4: Микрофотографии корональные разделы мозга демонстрирующие развитие опухоли у контрольных животных (А) и не опухоль головного мозга развития в AMG102 подопытных животных (B). Шкала бар 1 мм.

<ol>
	<li>Lal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+implantable+guide-screw+system+for+brain+tumor+studies+in+small+animals.">An implantable guide-screw system for brain tumor studies in small animals.</a> J Neurosurg. 92, 326-333 (2000).</li><li>Jun, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMG+102,+a+fully+human+anti-hepatocyte+growth+factor/scatter+factor+neutralizing+antibody,+enhances+the+efficacy+of+temozolomide+or+docetaxel+in+U-87+MG+cells+and+xenografts.">AMG 102, a fully human anti-hepatocyte growth factor/scatter factor neutralizing antibody, enhances the efficacy of temozolomide or docetaxel in U-87 MG cells and xenografts.</a> Clin Cancer Res. 13, 6735-6742 (2007).</li><li>Pillay, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plasticity+of+oncogene+addiction:+implications+for+targeted+therapies+directed+to+receptor+tyrosine+kinases.">The plasticity of oncogene addiction: implications for targeted therapies directed to receptor tyrosine kinases.</a> Neoplasia. 11, 448-458 (2009).</li><li>Buchanan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiosensitization+of+glioma+cells+by+modulation+of+Met+signaling+with+the+hepatocyte+growth+factor+neutralizing+antibody.+AMG102.">Radiosensitization of glioma cells by modulation of Met signaling with the hepatocyte growth factor neutralizing antibody. AMG102.</a> J Cell Mol Med. 15, 1999-2006 (2011).</li><li>Wen, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+II+study+evaluating+the+efficacy+and+safety+of+AMG+102+(rilotumumab)+in+patients+with+recurrent+glioblastoma.">A phase II study evaluating the efficacy and safety of AMG 102 (rilotumumab) in patients with recurrent glioblastoma.</a> Neuro Oncol. 13, 437-446 (2011).</li><li>Caretti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+Tumor+Growth+and+Post-Irradiation+Recurrence+in+a+Diffuse+Intrinsic+Pontine+Glioma+Mouse+Model.">Monitoring of Tumor Growth and Post-Irradiation Recurrence in a Diffuse Intrinsic Pontine Glioma Mouse Model.</a> Brain Pathol. 4, 441-451 (2011).</li><li>Jallo, G. I., Volkov, A., Wong, C., Carson, B. S., Penno, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+brainstem+tumor+model:+functional+and+histopathological+characterization.">A novel brainstem tumor model: functional and histopathological characterization.</a> Childs Nerv. Syst. 22, 1519-1525 (2006).</li><li>Johns, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+of+epidermal+growth+factor+receptor-specific+antibodies+against+gliomaxenografts+is+influenced+by+receptor+levels,+activation+status,+and+heterodimerization.">The efficacy of epidermal growth factor receptor-specific antibodies against gliomaxenografts is influenced by receptor levels, activation status, and heterodimerization.</a> Clin Cancer Res. 13, 1911-1925 (2007).</li><li>Scott, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+clinical+trial+with+monoclonal+antibody+ch806+targeting+transitional+state+and+mutant+epidermal+growth+factor+receptors.">A phase I clinical trial with monoclonal antibody ch806 targeting transitional state and mutant epidermal growth factor receptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 4071-4076 (2007).</li><li>Niyazi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+options+for+recurrent+malignant+glioma.">Therapeutic options for recurrent malignant glioma.</a> Radiother. Oncol. 98, 1-14 (2011).</li></ol>

Эта работа была поддержана Исследовательский грант Amgen Инк

Внутричерепное метод винт руководство представленные здесь позволяет быстро и воспроизводимые создание внутричерепного ксенотрансплантаты и в руках квалифицированный специалист животных, эта процедура очень легко выполняется без необходимости стереотаксического устройства. Наш метод сочетает в себе использование руководства винт, чтобы безошибочно находить область мозга, наиболее пригодных для развития опухоли в живом организме, и автоматизированные насос инфузий, что позволяет одновременно прививки до 10 животных одновременно. Увеличение руководство винт процедура занимает менее 5 минут для выполнения. Автоматизированные инфузии клеток в 30 мкл / час занимает всего 10 минут на 5 мкл. Это обеспечивает точное дозирование с постоянной скоростью и уменьшает риск клеточной изгнание в экстра-черепной области из-за повышенного внутричерепного давления. Мы также выполнили эту процедуру с 10 мкл объемы и не наблюдали каких-либо дополнительных черепно-рост опухоли из-за сотового рефлюкса. Как автоматизированные насос вливания также позволяет несколько животных, чтобы быть одновременно прививку можно вводить до 60 животных в час по сравнению с стереотаксической процедура, которая ограничена примерно 15 животных в час. Наиболее критичным этапом в этой процедуре является расположение руководства винт в черепе, как ее положение определяет конечную расположения опухоли навалом. Если руководство винт слишком центральных, клетки будут вводится в область между двумя полушариями мозга в то время как, если руководство находится в далеко вперед, клетки не будет выведена на мозг на всех. Поэтому крайне важно, чтобы быть как можно более точным в поиске руководства 2,5 мм боковые и 1 мм впереди брегмы 1. В данном исследовании мы использовали винт сталь руководство, хотя пластиковые винты руководство также доступны для тех исследований, которые требуют визуализации головного мозга, таких как МРТ или ПЭТ 6. Даже если автоматизированные насос настой сопряжено с запретом для некоторых групп, клетки все еще может быть введен вручную быстрее, чем стереотаксической подходы. В целом, это быстрый, точный и воспроизводимый метод может быть использован для изучения глиомы, медуллобластомой и опухоли ствола головного мозга 7. Эта процедура была выполнена на более чем 500 мышей между двумя нашими лабораториями с смертей от непредвиденной реакции анестезии (&lt;1%). Мыши, которые были болтами с гидом винт, а затем придают с клетки не умирают или страдают какой-либо неврологических осложнений в результате процедуры. Животные выжили последние 100 дней без каких-либо осложнений. Хотя мы предпочли использовать голые мыши, с ослабленным иммунитетом мышь с волосами, как SCID будет только по мере необходимости при условии, череп волосами был удален до операции для поддержания сайта чистым и не допустить вмешательства в волосах руководство винт. Есть несколько новых терапии в настоящее время разрабатываются для лечения глиомы 8-10. Недавно мы показали, что подкожный U87MG глиомы ксенотрансплантаты может быть запрещена путем обработки AMG102 3; гуманизированные антитела, направленные на HGF в настоящее время проходит клинические оценки в глиомы 5. Мы использовали метод описывать здесь, чтобы установить внутричерепного U87MG опухолей в мозге голым мышам. Наше исследование ясно показывает полезность метода и демонстрирует, что AMG102 достоверно тормозит рост ортотопической ксенотрансплантаты U87MG. Мы будем продолжать использовать эту модель, чтобы определить, какие другие терапии может быть использован в сочетании с AMG102 получить более эффективное ингибирование роста опухоли.

<table border="1"><tbody><tr><th> Название реагента </th><th> Компания </th><th> Номер в каталоге </th><th> Комментарии (необязательно) </th></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 12634010 </td><td></td></tr><tr><td> ФТС </td><td> Bovogen </td><td> SFBS </td><td></td></tr><tr><td> Трипсин </td><td> Invitrogen </td><td> 15050065 </td><td></td></tr><tr><td> ЭДТА </td><td> Сигма </td><td> E6758 </td><td></td></tr><tr><td> BALB / C ню / ню мышей </td><td> ARC Перт </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Винт держатель </td><td> Один пластмассы </td><td> SD-1 </td><td></td></tr><tr><td> Дрель держатель </td><td> Один пластмассы </td><td> DH-1 </td><td></td></tr><tr><td> Сверло </td><td> Один пластмассы </td><td> D # 60 </td><td></td></tr><tr><td> Винт направляющей (металл) </td><td> Один пластмассы </td><td> C212SG </td><td></td></tr><tr><td> Винт Dummy (стилуса) </td><td> Один пластмассы </td><td> C212SD </td><td></td></tr><tr><td> Гамильтон шприц (10 мкл 26г укрепил иглы) </td><td> Грейс отдел Discovery Science </td><td> 80075 </td><td></td></tr><tr><td> PHD 22/2000 инфузионного насоса </td><td> Гарвардский аппарата </td><td> 70-2003 </td><td> Необязательный </td></tr><tr><td> Vetbond </td><td> 3М </td><td> 1469SB </td><td></td></tr><tr><td> Термо площадку </td><td> Гарвардский аппарата </td><td> 340390 </td><td></td></tr></tbody></table>

a simple guide screw method for intracranial xenograft studies in mice

Пересадка человеческих опухолевых клеток в мозге мышей иммунитетом является признанным методом для изучения рака мозга в том числе глиобластомы (глиомы) и медуллобластомой. Широко используется стереотаксическая подход позволяет только для введения одного животного за один раз, является трудоемким и требует высокой специализированного оборудования. Метод руководства винт, первоначально разработанный Лал и соавт., 1 был разработан для устранения обременительные процедуры стереотаксической. Опишем изменение подхода руководства винт, который является быстрым и исключительно безопасным; обе из которых имеют важное значение этических соображений. Примечательно, что наша процедура теперь включает инфузионный насос, который позволяет до 10 животных, чтобы быть одновременно вводили опухолевые клетки. Чтобы продемонстрировать полезность этой процедуры, мы создали человеческие клетки глиомы U87MG как внутричерепное ксенотрансплантаты у мышей, которые были затем обрабатывают AMG102, полностью человеческие антитела, направленные на HGF / разброс фактора в настоящее время проходит клинические 2-5 оценки. Системное введение AMG102 значительно увеличивал выживаемость всех мышей с внутричерепной ксенотрансплантаты U87MG и в результате число полных лечит. Это исследование показывает, что метод руководства винт недорогой, высокой воспроизводимостью подход к созданию внутричерепного ксенотрансплантаты. Кроме того, он предоставляет соответствующую физиологическую модель для проверки новых терапевтических стратегий для лечения рака мозга.

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice at JoVE.com

A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

Для оценки новых терапевтических парадигм для лечения глиомы, физиологические соответствующих моделей имеют важное значение. Мы используем имплантируемых процедуры винт руководства для создания моделей внутричерепного ксенотрансплантата, который является более быстрым и безопасным, чем стереотаксической подходы.

Простой метод Винт Руководство по Внутричерепное ксенотрансплантата Исследования на мышах

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Guide Wire Assisted Catheterization and Colored Dye Injection for Vascular Mapping of Monochorionic Twin Placentas

Руководство Wire Assisted катетеризации и цветные краски для закачки сосудистой Картирование монохориальной Твин плаценты

Monochorionic (MC) twin pregnancies are associated with significantly higher morbidity and mortality rates than dichorionic twins. Approximately 50% of MC ...

Epidural Intracranial Pressure Measurement in Rats Using a Fiber-optic Pressure Transducer

Эпидуральная внутричерепного Измерение давления у крыс с помощью волоконно-оптических преобразователей давления

Elevated intracranial pressure (ICP) is a significant problem in several forms of ischemic brain injury including stroke, traumatic brain injury and ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

Простой метод мышь интубации легких

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

<em&gt; В ово</em&gt; CAM-анализа, как Xenograftmodel саркомы

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Сонной артерии Настои для Фармакокинетические и фармакодинамические анализ Таксаны в мышах

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

Простой Critical размера бедренной кости Дефект Модель на мышах

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all ...

Utilizing an Orally Dissolving Strip for Pharmacological and Toxicological Studies: A Simple and Humane Alternative to Oral Gavage for Animals

Использование орально растворяя Газа для фармакологических и токсикологических исследований: простая и гуманная альтернатива желудочный зонд для животных

Prior to testing novel therapeutics in humans, short and long term preclinical (i.e., animal), repetitive pharmacological and toxicological testing is ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

Усовершенствованный метод Rapid интубации трахеи у мышей

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

Метод Количественная верхней конечности производительности в повседневной жизни при помощи акселерометров

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...

Observational Study Protocol for Repeated Clinical Examination and Critical Care Ultrasonography Within the Simple Intensive Care Studies

Обсервационное исследование протокол для повторного клинического обследования и критических уход УЗИ в рамках исследования простой интенсивной терапии

Longitudinal evaluations of critically ill patients by combinations of clinical examination, biochemical analysis and critical care ultrasonography (CCUS) ...