Name: visualizing dengue virus through alexa fluor labeling
Uploaded: 2011-07-09T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door de National Medical Research Council, Singapore.

1. Alexa Fluor etikettering van dengue virus <ol><li> Voor de etikettering reactie, zuiveren dengue virus met sucrose kussen en de voorbereiding van de benodigde reagentia en apparatuur, zoals aangegeven in het protocol. </li><li> Bereid verse 0,2 M natriumbicarbonaat buffer, pH 8,5 (etikettering buffer), en 1.5M hydroxylamine buffer, pH 8,3 (stop reagens), vlak voor de etikettering en filter steriliseren met 0.2μm spuit filters. </li><li> Verdunnen van ongeveer 3x10 8 plaque-vormende eenheden (pfu) van ge...

<ol>
	<li>Olenych, S. G., Claxton, N. S., Ottenberg, G. K. &. a. m. p. ;. a. m. p., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fluorescent+Protein+Color+Palette.">The Fluorescent Protein Color Palette.</a> Current Protocols in Cell Biology. 21.5, 1-34 (2007).</li><li>Panchuk-Voloshina, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alexa+dyes,+a+series+of+new+fluorescent+dyes+that+yield+exceptionally+bright,+photostable+conjugates.">Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates.</a> J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).</li><li>Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+fluorescent+protein+technology.">Advances in fluorescent protein technology.</a> J Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+use+of+fluorescent+protein+markers+in+living+cells.">Development and use of fluorescent protein markers in living cells.</a> Science. 300, 87-91 (2003).</li><li>Kuhn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+dengue+virus:+implications+for+flavivirus+organization,+maturation,+and+fusion.">Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion.</a> Cell. 108, 717-725 (2002).</li><li>Aguilar, J. S., Roy, D., Ghazal, P., Wagner, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimethyl+sulfoxide+blocks+herpes+simplex+virus-1+productive+infection+in+vitro+acting+at+different+stages+with+positive+cooperativity.+Application+of+micro-array+analysis.">Dimethyl sulfoxide blocks herpes simplex virus-1 productive infection in vitro acting at different stages with positive cooperativity. Application of micro-array analysis.</a> BMC Infect Dis. 2, 9-9 (2002).</li><li>Zhang, S. L., Tan, H. C., Hanson, B. J., Ooi, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+Alexa+Fluor+dye+labelling+of+dengue+virus.">A simple method for Alexa Fluor dye labelling of dengue virus.</a> J Virol Methods. 167, 172-177 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Alexa Fluor Succinimidyl Esters (Molecular Probes. , (2009).</li><li>Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+proteins+stained+by+Alexa+dyes.">Analysis of proteins stained by Alexa dyes.</a> Electrophoresis. 25, 779-784 (2004).</li><li>Freistadt, M. S., Eberle, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+poliovirus+for+flow+cytometric+cell+surface+binding+studies.">Fluorescent poliovirus for flow cytometric cell surface binding studies.</a> J Virol Methods. 134, 1-7 (2006).</li></ol>

Hoewel AF594 kleurstof werd gebruikt in dit rapport, een brede waaier van fluoroforen in de Alexa Fluor succinimidyl esters serie is leverbaar met vergelijkbare etikettering chemie. Dit kan uitbreiding van de etikettering van toepassing buiten beeldvorming. Flowcytometrie kan worden gebruikt als een alternatief voor de confocale microscopie voor het schatten van de mate van etikettering voor fluoroforen die kunnen worden opgewonden en gedetecteerd door de FACS apparaat. Alexa Fluor kleurstof...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Commentaar (optioneel) </th></tr><tr><td> Natriumbicarbonaat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> Hydroxylamine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 159417 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumhydroxide </td><td> Merck </td><td> 106498 </td><td></td></tr><tr><td> AF594 succinimidyl esters </td><td> Molecular Probes, Invitrogen </td><td> A20004 </td><td></td></tr><tr><td> PD-10 kolom </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0851-01 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H6147 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> M-199 </td><td> Invitrogen </td><td> 11150 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td><td></td></tr><tr><td> 4-well plaat </td><td> Nunc </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Coverslips </td><td> Einst </td><td> 0111520 </td><td></td></tr><tr><td> Microscoopglaasje </td><td> Sail Brand </td><td> 7105 </td><td></td></tr><tr><td> 3H5 hybridoma </td><td> ATCC </td><td> HB46 </td><td></td></tr><tr><td> 10x PBS </td><td> 1e Base </td><td> BUF-2040-10X1L </td><td></td></tr><tr><td> Saponine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S4521 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7906 </td><td></td></tr><tr><td> Magnesiumchloride </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2670 </td><td></td></tr><tr><td> Calciumchloride </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3306 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehye </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 15,812-7 </td><td></td></tr><tr><td> Mowiol 4-88 </td><td> Calbiochem </td><td> 475904 </td><td></td></tr><tr><td> DABCO </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D27802 </td><td></td></tr><tr><td> Tafelblad centrifuge </td><td> Eppendorf </td><td> 5424 </td><td></td></tr><tr><td> Confocale microscoop </td><td> Zeiss </td><td> LSM 710 </td><td></td></tr></tbody></table> Voor te bereiden M-199 groeimedium, voeg 50 ml van FBS, 5 ml natrium pyruvaat en 5 ml van de niet-essentiële aminozuren tot 500 ml van M-199, steriele filter. Voor te bereiden M-199 onderhoud medium, voeg 15 ml van FBS, 5 ml natrium pyruvaat en 5 ml van de niet-essentiële aminozuren tot 500 ml van M-199, steriele filter.

visualizing dengue virus through alexa fluor labeling

De vroege gebeurtenissen in de interactie tussen virus en cel kan hebben grote invloed op de uitkomst van de infectie. Het bepalen van de factoren die deze interactie van invloed zou kunnen leiden tot een beter begrip van de ziekte pathogenese en dus invloed vaccins of therapeutische design. Daarom zou de ontwikkeling van methoden om deze interactie probe nuttig zijn. Recente ontwikkelingen in fluoroforen ontwikkeling 1-3 en imaging technologie 4 kan worden benut om onze huidige kennis over dengue pathogenese te verbeteren en zo de weg vrijmaken voor de miljoenen van dengue besmettingen per jaar te verminderen. De omhulde dengue-virus heeft een externe steiger bestaat uit 90 enveloppe glycoproteïne (E)-dimeren de bescherming van de nucleocapside shell, die een enkele positieve streng RNA genoom 5 bevat. De identieke eiwitsubeenheden op het virus oppervlak kan dus worden voorzien van een amine reactieve kleurstof en gevisualiseerd door middel van immunofluorescentie microscopie. Hier presenteren we een eenvoudige methode voor de etikettering van dengue virus met Alexa Fluor succinimidylester kleurstof direct opgelost in een natriumbicarbonaat buffer die zeer levensvatbaar virus leverde na labeling. Er is geen gestandaardiseerde procedure voor de etikettering van levend virus en bestaande fabrikant protocol voor het eiwit labeling meestal de reconstructie van kleurstof in dimethylsulfoxide vereist. De aanwezigheid van dimethylsulfoxide, zelfs in kleine hoeveelheden, kan blokkeren productieve infectie van het virus en ook leiden tot cel cytotoxiciteit 6. De uitsluiting van het gebruik van dimethylsulfoxide in dit protocol zo beperkt deze mogelijkheid. Alexa Fluor kleurstoffen hebben superieure fotostabiliteit en zijn minder pH-gevoelig dan de gewone kleurstoffen, zoals fluoresceïne en rhodamine 2, waardoor ze ideaal zijn voor het onderzoek naar cellulaire opname en endosomale transport van het virus. De vervoeging van Alexa Fluor kleurstof had geen invloed op de opname van gelabelde dengue-virus door virus-specifieke antilichamen en zijn vermeende receptoren in gastheercellen 7. Deze methode zou kunnen hebben nuttige toepassingen in virologische studies.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling at JoVE.com

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

Profiterend van de vooruitgang in de ontwikkeling fluorofoor en imaging technologie, een eenvoudige methode van Alexa Fluor etikettering van dengue virus was ontwikkeld om het begin van de interacties tussen virus en cel visualiseren.

Visualiseren van Dengue Virus via Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofielen Isolatie en analyse van hun rol in de Lymphoma Cell Gevoeligheid voor therapeutische middelen te bepalen

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Evaluatie van de effectiviteit en toxiciteit van RNA&#39;s Targeting HIV-1 productie voor gebruik in Gene of Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Redding en karakterisering van het recombinante virus van een nieuwe infectieuze kloon van de Zika Virus

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Visualiseren van extracellulaire Traps Macrophage met behulp van de Confocal Microscopie

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Een eenvoudige Stroom Cytometry gebaseerd Assay om te bepalen In Vitro antilichaam afhankelijk verbetering van Dengue Virus met behulp van de herstellende Serum Zika-Virus

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Snelle, veilige en eenvoudige handleiding bed nucleïnezuur extractie voor de opsporing van Virus in monsters van volbloed

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

Meten van Dengue Virus RNA in het Supernatant van cultuur van geïnfecteerde cellen door Real-time kwantitatieve Polymerase-kettingreactie

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

Identificatie van de codering en niet-coderende RNA klassen uitgedrukt in varkens volbloed

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

A Murine Model of Dengue Virus-induced Acute Viral Encephalitis-like Disease

Een Muriene model van dengue virus-geïnduceerde acute virale encefalitis-achtige ziekte

Dengue virus (DENV), an arthropod-borne virus transmitted by mosquitoes, may cause the severe disease known as dengue hemorrhagic fever, which is ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

In Vitro ELISA-test om de potentie van rabiësvaccin te evalueren

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...