Name: visualizing dengue virus through alexa fluor labeling
Uploaded: 2011-07-09T12:00:00
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Ce travail a été financé par le Conseil national de la recherche médicale, à Singapour.

1. Alexa Fluor étiquetage des virus de la dengue <ol><li> Avant la réaction de marquage, de purifier virus de la dengue avec coussin de saccharose et de préparer les réactifs et les équipements nécessaires, comme indiqué dans le protocole. </li><li> Préparer une solution fraîche de tampon 0,2 M de bicarbonate de sodium, pH 8,5 (tampon de marquage), et 1,5 M de tampon d&#39;hydroxylamine, pH 8,3 (arrêt réactif), juste avant l&#39;étiquetage et stériliser par filtration avec des filtres seringue 0,2 um. </l...

<ol>
	<li>Olenych, S. G., Claxton, N. S., Ottenberg, G. K. &. a. m. p. ;. a. m. p., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fluorescent+Protein+Color+Palette.">The Fluorescent Protein Color Palette.</a> Current Protocols in Cell Biology. 21.5, 1-34 (2007).</li><li>Panchuk-Voloshina, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alexa+dyes,+a+series+of+new+fluorescent+dyes+that+yield+exceptionally+bright,+photostable+conjugates.">Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates.</a> J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).</li><li>Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+fluorescent+protein+technology.">Advances in fluorescent protein technology.</a> J Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+use+of+fluorescent+protein+markers+in+living+cells.">Development and use of fluorescent protein markers in living cells.</a> Science. 300, 87-91 (2003).</li><li>Kuhn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+dengue+virus:+implications+for+flavivirus+organization,+maturation,+and+fusion.">Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion.</a> Cell. 108, 717-725 (2002).</li><li>Aguilar, J. S., Roy, D., Ghazal, P., Wagner, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimethyl+sulfoxide+blocks+herpes+simplex+virus-1+productive+infection+in+vitro+acting+at+different+stages+with+positive+cooperativity.+Application+of+micro-array+analysis.">Dimethyl sulfoxide blocks herpes simplex virus-1 productive infection in vitro acting at different stages with positive cooperativity. Application of micro-array analysis.</a> BMC Infect Dis. 2, 9-9 (2002).</li><li>Zhang, S. L., Tan, H. C., Hanson, B. J., Ooi, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+Alexa+Fluor+dye+labelling+of+dengue+virus.">A simple method for Alexa Fluor dye labelling of dengue virus.</a> J Virol Methods. 167, 172-177 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Alexa Fluor Succinimidyl Esters (Molecular Probes. , (2009).</li><li>Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+proteins+stained+by+Alexa+dyes.">Analysis of proteins stained by Alexa dyes.</a> Electrophoresis. 25, 779-784 (2004).</li><li>Freistadt, M. S., Eberle, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+poliovirus+for+flow+cytometric+cell+surface+binding+studies.">Fluorescent poliovirus for flow cytometric cell surface binding studies.</a> J Virol Methods. 134, 1-7 (2006).</li></ol>

Bien AF594 colorant a été utilisé dans ce rapport, une large gamme de fluorophores dans la série Alexa Fluor esters succinimidyle est disponible avec la chimie étiquetage similaire. Cela pourrait étendre l&#39;application de l&#39;étiquetage au-delà de l&#39;imagerie. La cytométrie en flux peut être utilisé comme une alternative à la microscopie confocale pour estimer le degré d&#39;étiquetage pour les fluorophores qui peuvent être excités et détectés par la machine FACS. A...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> Le bicarbonate de sodium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> Hydroxylamine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 159417 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;hydroxyde de sodium </td><td> Merck </td><td> 106498 </td><td></td></tr><tr><td> AF594 esters succinimidyle </td><td> Molecular Probes, Invitrogen </td><td> A20004 </td><td></td></tr><tr><td> Colonne PD-10 </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0851-01 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H6147 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> M-199 </td><td> Invitrogen </td><td> 11150 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td><td></td></tr><tr><td> 4-même la plaque </td><td> Nunc </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Lamelles </td><td> Einst </td><td> 0111520 </td><td></td></tr><tr><td> Lame de microscope </td><td> Voile Marque </td><td> 7105 </td><td></td></tr><tr><td> 3H5 hybridomes </td><td> ATCC </td><td> HB46 </td><td></td></tr><tr><td> 10x PBS </td><td> 1er but </td><td> BUF-2040-10X1L </td><td></td></tr><tr><td> La saponine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S4521 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7906 </td><td></td></tr><tr><td> Le chlorure de magnésium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2670 </td><td></td></tr><tr><td> Le chlorure de calcium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3306 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehye </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 15,812-7 </td><td></td></tr><tr><td> Mowiol 4-88 </td><td> Calbiochem </td><td> 475904 </td><td></td></tr><tr><td> Dabco </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D27802 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifugeuse de table </td><td> Eppendorf </td><td> 5424 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope confocal </td><td> Zeiss </td><td> LSM 710 </td><td></td></tr></tbody></table> Pour préparer M-199 un milieu de croissance, ajouter 50 ml de FBS, 5ml de pyruvate de sodium et de 5ml de non-acides aminés essentiels à 500ml de M-199, filtre stérile. Pour préparer M-199 milieu d&#39;entretien, ajouter 15 ml de FBS, 5ml de pyruvate de sodium et de 5ml de non-acides aminés essentiels à 500ml de M-199, filtre stérile.

visualizing dengue virus through alexa fluor labeling

Les événements au début de l&#39;interaction entre le virus et la cellule peut avoir une influence profonde sur l&#39;issue de l&#39;infection. Déterminer les facteurs qui influencent cette interaction pourrait conduire à une meilleure compréhension de la pathogenèse de la maladie et ainsi influencer la conception de vaccin ou thérapeutiques. Ainsi, le développement de méthodes pour sonder cette interaction pourrait être utile. Les récents progrès dans le développement des fluorophores 1-3 et la technologie d&#39;imagerie 4 peut être exploitée pour améliorer nos connaissances actuelles sur la pathogénie de la dengue et d&#39;ouvrir ainsi la voie pour réduire les millions de cas de dengue survenant chaque année. Le virus de la dengue a enveloppé une externes échafaudage constitué de 90 glycoprotéine de l&#39;enveloppe (E) dimères protégeant le réservoir nucléocapside, qui contient un seul brin ARN positif du génome 5. Les sous-unités protéiques identiques sur la surface du virus peuvent donc être étiquetés avec un colorant amine réactive et visualisées par microscopie d&#39;immunofluorescence. Ici, nous présentons une méthode simple de l&#39;étiquetage des virus de la dengue avec Alexa Fluor succinimidyl ester colorant dissous directement dans un tampon bicarbonate de sodium qui a produit virus hautement viable après l&#39;étiquetage. Il n&#39;ya pas de procédure standardisée pour l&#39;étiquetage des virus vivants et le protocole du fabricant existants pour l&#39;étiquetage des protéines nécessite généralement la reconstitution de la teinture dans le diméthylsulfoxyde. La présence de diméthylsulfoxyde, même en quantités infimes, peut bloquer l&#39;infection productive des virus et aussi induire 6 cytotoxicité cellulaire. L&#39;exclusion de l&#39;utilisation de diméthylsulfoxyde dans ce protocole ainsi réduit cette possibilité. Alexa Fluor colorants ont photostabilité supérieure et sont moins sensibles au pH que les colorants communs, tels que la fluorescéine et la rhodamine 2, ce qui les rend idéales pour des études sur l&#39;absorption cellulaire et le transport endosomal du virus. La conjugaison de Alexa Fluor colorant n&#39;a pas d&#39;incidence sur la reconnaissance du virus de la dengue labellisé par le virus de l&#39;anticorps spécifique et de ses récepteurs putatifs en 7 cellules de l&#39;hôte. Cette méthode pourrait avoir des applications utiles dans les études virologiques.

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Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

Profitant des avancées dans le développement de fluorophore et la technologie d&#39;imagerie, une méthode simple de Alexa Fluor étiquetage des virus de la dengue a été conçu pour visualiser les interactions précoces entre le virus et la cellule.

Visualisation virus de la dengue grâce à Alexa Fluor Étiquetage

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Research

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Neutrophiles Isolement et analyse pour déterminer leur rôle dans le lymphome cellulaire Sensibilité aux agents thérapeutiques

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

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