Name: visualizing dengue virus through alexa fluor labeling
Uploaded: 2011-07-09T12:00:00
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Diese Arbeit wurde von der National Medical Research Council, Singapore finanziert.

1. Alexa Fluor Kennzeichnung von Dengue-Virus <ol><li> Vor der Kennzeichnung Reaktion zu reinigen Dengue-Virus mit Saccharose-Kissen und bereiten die notwendigen Reagenzien und Geräte wie im Protokoll angegeben. </li><li> Bereiten Sie frische 0,2 M Natriumbicarbonat-Puffer, pH 8,5 (Kennzeichnung Puffer) und 1,5 M Hydroxylamin, pH 8,3 (Stop-Reagenz), kurz bevor die Kennzeichnung und Filter mit 0,2 um Spritzenfilter sterilisieren. </li><li> Verdünnen Sie ca. 3x10 8 Plaque-bildenden Einheiten (pfu) von gerei...

<ol>
	<li>Olenych, S. G., Claxton, N. S., Ottenberg, G. K. &. a. m. p. ;. a. m. p., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fluorescent+Protein+Color+Palette.">The Fluorescent Protein Color Palette.</a> Current Protocols in Cell Biology. 21.5, 1-34 (2007).</li><li>Panchuk-Voloshina, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alexa+dyes,+a+series+of+new+fluorescent+dyes+that+yield+exceptionally+bright,+photostable+conjugates.">Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates.</a> J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).</li><li>Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+fluorescent+protein+technology.">Advances in fluorescent protein technology.</a> J Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+use+of+fluorescent+protein+markers+in+living+cells.">Development and use of fluorescent protein markers in living cells.</a> Science. 300, 87-91 (2003).</li><li>Kuhn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+dengue+virus:+implications+for+flavivirus+organization,+maturation,+and+fusion.">Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion.</a> Cell. 108, 717-725 (2002).</li><li>Aguilar, J. S., Roy, D., Ghazal, P., Wagner, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimethyl+sulfoxide+blocks+herpes+simplex+virus-1+productive+infection+in+vitro+acting+at+different+stages+with+positive+cooperativity.+Application+of+micro-array+analysis.">Dimethyl sulfoxide blocks herpes simplex virus-1 productive infection in vitro acting at different stages with positive cooperativity. Application of micro-array analysis.</a> BMC Infect Dis. 2, 9-9 (2002).</li><li>Zhang, S. L., Tan, H. C., Hanson, B. J., Ooi, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+Alexa+Fluor+dye+labelling+of+dengue+virus.">A simple method for Alexa Fluor dye labelling of dengue virus.</a> J Virol Methods. 167, 172-177 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Alexa Fluor Succinimidyl Esters (Molecular Probes. , (2009).</li><li>Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+proteins+stained+by+Alexa+dyes.">Analysis of proteins stained by Alexa dyes.</a> Electrophoresis. 25, 779-784 (2004).</li><li>Freistadt, M. S., Eberle, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+poliovirus+for+flow+cytometric+cell+surface+binding+studies.">Fluorescent poliovirus for flow cytometric cell surface binding studies.</a> J Virol Methods. 134, 1-7 (2006).</li></ol>

Obwohl AF594 Farbstoff in diesem Bericht verwendet wurde, ist eine breite Palette von Fluorophoren in der Alexa Fluor Succinimidylestern Serie mit ähnlichen Kennzeichnung Chemie. Dies könnte zu verlängern die Kennzeichnung Anwendung über Bildgebung. Die Durchflusszytometrie kann als Alternative zur konfokalen Mikroskopie für die Einschätzung des Grades der Kennzeichnung für Fluorophore, die angeregt und detektiert werden durch die FACS-Maschine verwendet werden kann. Alexa Fluor-Farbs...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Natriumbicarbonat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> Hydroxylamin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 159417 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumhydroxid </td><td> Merck </td><td> 106498 </td><td></td></tr><tr><td> AF594 Succinimidylestern </td><td> Molecular Probes, Invitrogen </td><td> A20004 </td><td></td></tr><tr><td> PD-10 Säule </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0851-01 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H6147 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> M-199 </td><td> Invitrogen </td><td> 11150 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td><td></td></tr><tr><td> 4-Well-Platte </td><td> Nunc </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Deckgläser </td><td> Einst </td><td> 0111520 </td><td></td></tr><tr><td> Objektträger </td><td> Sail Marke </td><td> 7105 </td><td></td></tr><tr><td> 3H5 Hybridom </td><td> ATCC </td><td> HB46 </td><td></td></tr><tr><td> 10x PBS </td><td> 1st Base </td><td> BUF-2040-10X1L </td><td></td></tr><tr><td> Saponin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S4521 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7906 </td><td></td></tr><tr><td> Magnesiumchlorid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2670 </td><td></td></tr><tr><td> Calciumchlorid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3306 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehye </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 15,812-7 </td><td></td></tr><tr><td> Mowiol 4-88 </td><td> Calbiochem </td><td> 475904 </td><td></td></tr><tr><td> Dabco </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D27802 </td><td></td></tr><tr><td> Tischzentrifuge </td><td> Eppendorf </td><td> 5424 </td><td></td></tr><tr><td> Konfokalen Mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> LSM 710 </td><td></td></tr></tbody></table> Zur Vorbereitung M-199 Wachstumsmedium, fügen Sie 50 ml FBS, 5 ml Natriumpyruvat und 5 ml nicht-essentiellen Aminosäuren zu 500ml M-199, sterile Filter. Zur Vorbereitung M-199 Wartungs-Medium, fügen Sie 15 ml FBS, 5 ml Natriumpyruvat und 5 ml nicht-essentiellen Aminosäuren zu 500ml M-199, sterile Filter.

visualizing dengue virus through alexa fluor labeling

Die frühen Ereignisse bei der Interaktion zwischen Virus und Zelle kann großen Einfluss auf das Ergebnis der Infektion haben. Ermittlung der Faktoren, die diese Interaktion beeinflussen könnten zu einem besseren Verständnis der Pathogenese der Erkrankung führen und damit Einfluss Impfstoff oder therapeutische Design. Daher wäre die Entwicklung von Methoden, um diese Wechselwirkung Sonde nützlich sein. Jüngste Fortschritte in der Entwicklung Fluorophore 1-3 und Imaging-Technologie 4 kann ausgenutzt werden, um unserem derzeitigen Kenntnisstand auf Dengue Pathogenese zu verbessern und somit den Weg zu den Millionen von Dengue-Infektionen, die jährlich zu reduzieren. Der umhüllte Dengue-Virus verfügt über eine externe Gerüst, bestehend aus 90 Hüllglycoprotein (E)-Dimere Schutz der Nukleokapsid Schale, die eine einzelne positive Strang-RNA-Genom 5 enthält. Die identische Protein-Untereinheiten auf der Virusoberfläche können somit mit einem Amin reaktiven Farbstoff markiert und visualisiert werden durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie. Hier präsentieren wir eine einfache Methode zur Kennzeichnung von Dengue-Virus mit Alexa Fluor Succinimidylester Farbstoff direkt in einem Natriumbicarbonatpuffer, die sehr tragfähig Virus nach der Kennzeichnung ergab aufgelöst. Es gibt kein standardisiertes Verfahren für die Kennzeichnung von lebenden Virus und bestehenden Protokoll des Herstellers für Protein-Kennzeichnung erfordert in der Regel die Wiederherstellung der Farbstoff in Dimethylsulfoxid. Die Anwesenheit von Dimethylsulfoxid, selbst in kleinsten Mengen, blockieren kann produktive Infektion von Viren und induzieren auch Zell-Zytotoxizität 6. Der Ausschluss von der Verwendung von Dimethylsulfoxid in diesem Protokoll somit reduziert diese Möglichkeit. Alexa Fluor Farbstoffe überlegen Photostabilität und sind weniger pH-empfindlicher als die gemeinsame Farbstoffe wie Fluorescein und Rhodamin 2, wodurch sie ideal für Studien zur zellulären Aufnahme und endosomalen Transport des Virus. Die Konjugation von Alexa Fluor Farbstoff keinen Einfluss auf die Anerkennung der Bezeichnung Dengue-Virus durch Virus-spezifische Antikörper und ihre vermeintliche Rezeptoren in Host-Zellen 7. Diese Methode könnte nützliche Anwendungen in der virologischen Untersuchungen.

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Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

Unter Ausnutzung der Fortschritte in der Fluorophor Entwicklung und Imaging-Technologie, eine einfache Methode, Alexa Fluor Kennzeichnung von Dengue-Virus entwickelt, um den frühen Interaktionen zwischen Virus und Zelle sichtbar war.

Visualizing Dengue Virus durch Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophilen-Isolierung und Analyse zur Bestimmung ihrer Rolle in der Lymphom-Zellempfindlichkeit therapeutische Mittel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNAs Targeting HIV-1-Produktion für den Einsatz in Gene oder Arzneimitteltherapie

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Rettung und Charakterisierung des rekombinanten Virus aus einer neuen Welt Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Visualisierung von Makrophagen extrazelluläre fallen mit der konfokalen Mikroskopie

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Eine einfache Durchflusszytometrie basierten Test um festzustellen, In-vitro- Antikörper abhängige Verbesserung des Dengue-Virus mit Zika-Virus genesenden Serum

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Schnelle, sichere und einfache manuelle am Krankenbett Nukleinsäure-Extraktion für den Nachweis des Virus in Vollblut-Proben

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

Messung der Dengue-Virus RNA im Kultur Überstand der infizierten Zellen durch Echtzeit-Quantitative Polymerase-Kettenreaktion

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

Identifizierung der Codierung und nicht-kodierende RNA-Klassen ausgedrückt bei Schweinen Vollblut

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

A Murine Model of Dengue Virus-induced Acute Viral Encephalitis-like Disease

Ein murines Modell der Dengue-Virus-induzierten akuten viralen Enzephalitis-ähnlichen Krankheit

Dengue virus (DENV), an arthropod-borne virus transmitted by mosquitoes, may cause the severe disease known as dengue hemorrhagic fever, which is ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

In Vitro ELISA-Test zur Bewertung der Wirksamkeit von Tollwut-Impfstoffen

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...