Name: visualizing dengue virus through alexa fluor labeling
Uploaded: 2011-07-09T12:00:00
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Questo lavoro è stato finanziato dal Medical Consiglio Nazionale delle Ricerche, Singapore.

1. Alexa Fluor etichettatura dei virus dengue <ol><li> Prima che la reazione di marcatura, purificare virus della dengue con cuscino di saccarosio e preparare i reagenti necessari e le attrezzature, come indicato nel protocollo. </li><li> Preparare fresca 0,2 M tampone bicarbonato di sodio, pH 8,5 (tampone etichettatura), e 1,5 M tampone idrossilammina, pH 8.3 (fermata reagente), poco prima di etichettatura e filtro sterilizzare con filtri per siringa 0.2μm. </li><li> Diluire a circa 3x10 8 unità placca f...

<ol>
	<li>Olenych, S. G., Claxton, N. S., Ottenberg, G. K. &. a. m. p. ;. a. m. p., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fluorescent+Protein+Color+Palette.">The Fluorescent Protein Color Palette.</a> Current Protocols in Cell Biology. 21.5, 1-34 (2007).</li><li>Panchuk-Voloshina, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alexa+dyes,+a+series+of+new+fluorescent+dyes+that+yield+exceptionally+bright,+photostable+conjugates.">Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates.</a> J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).</li><li>Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+fluorescent+protein+technology.">Advances in fluorescent protein technology.</a> J Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+use+of+fluorescent+protein+markers+in+living+cells.">Development and use of fluorescent protein markers in living cells.</a> Science. 300, 87-91 (2003).</li><li>Kuhn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+dengue+virus:+implications+for+flavivirus+organization,+maturation,+and+fusion.">Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion.</a> Cell. 108, 717-725 (2002).</li><li>Aguilar, J. S., Roy, D., Ghazal, P., Wagner, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimethyl+sulfoxide+blocks+herpes+simplex+virus-1+productive+infection+in+vitro+acting+at+different+stages+with+positive+cooperativity.+Application+of+micro-array+analysis.">Dimethyl sulfoxide blocks herpes simplex virus-1 productive infection in vitro acting at different stages with positive cooperativity. Application of micro-array analysis.</a> BMC Infect Dis. 2, 9-9 (2002).</li><li>Zhang, S. L., Tan, H. C., Hanson, B. J., Ooi, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+Alexa+Fluor+dye+labelling+of+dengue+virus.">A simple method for Alexa Fluor dye labelling of dengue virus.</a> J Virol Methods. 167, 172-177 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Alexa Fluor Succinimidyl Esters (Molecular Probes. , (2009).</li><li>Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+proteins+stained+by+Alexa+dyes.">Analysis of proteins stained by Alexa dyes.</a> Electrophoresis. 25, 779-784 (2004).</li><li>Freistadt, M. S., Eberle, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+poliovirus+for+flow+cytometric+cell+surface+binding+studies.">Fluorescent poliovirus for flow cytometric cell surface binding studies.</a> J Virol Methods. 134, 1-7 (2006).</li></ol>

Anche se AF594 colorante è stato utilizzato in questo rapporto, una vasta gamma di fluorofori nella serie Alexa Fluor succinimidile esteri è disponibile con la chimica etichettatura simili. Questo potrebbe estendere l&#39;applicazione dell&#39;etichettatura di là di imaging. Citometria a flusso può essere usato come alternativa alla microscopia confocale per valutare il grado di etichettatura per fluorofori che può essere eccitato e individuate dalla macchina FACS. Alexa Fluor coloranti...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> Bicarbonato di sodio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> Idrossilammina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 159417 </td><td></td></tr><tr><td> Idrossido di sodio </td><td> Merck </td><td> 106498 </td><td></td></tr><tr><td> AF594 esteri succinimidile </td><td> Sonde molecolari, Invitrogen </td><td> A20004 </td><td></td></tr><tr><td> PD-10 colonna </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0851-01 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H6147 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> M-199 </td><td> Invitrogen </td><td> 11150 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td><td></td></tr><tr><td> 4 pozzetti </td><td> Nunc </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Coprioggetto </td><td> Einst </td><td> 0111520 </td><td></td></tr><tr><td> Vetrino da microscopio </td><td> Vela Marca </td><td> 7105 </td><td></td></tr><tr><td> Ibridomi 3H5 </td><td> ATCC </td><td> HB46 </td><td></td></tr><tr><td> 10x PBS </td><td> 1 Base </td><td> BUF-2040-10X1L </td><td></td></tr><tr><td> Saponina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S4521 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7906 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro di magnesio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2670 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro di calcio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3306 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehye </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 15,812-7 </td><td></td></tr><tr><td> Mowiol 4-88 </td><td> Calbiochem </td><td> 475904 </td><td></td></tr><tr><td> DABCO </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D27802 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifuga da tavolo </td><td> Eppendorf </td><td> 5424 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio confocale </td><td> Zeiss </td><td> LSM 710 </td><td></td></tr></tbody></table> Per preparare M-199 terreno di coltura, aggiungere 50 ml di FBS, 5 ml di piruvato di sodio e 5 ml di aminoacidi non essenziali a 500 ml di M-199, filtro sterile. Per preparare M-199 terreno di mantenimento, aggiungere 15 ml di FBS, 5 ml di piruvato di sodio e 5 ml di aminoacidi non essenziali a 500 ml di M-199, filtro sterile.

visualizing dengue virus through alexa fluor labeling

Gli eventi presto l&#39;interazione tra virus e cellule possono avere un&#39;influenza profonda sul risultato di infezione. Determinare i fattori che influenzano questa interazione potrebbe portare a una migliore comprensione della patogenesi della malattia e quindi influenzare vaccino terapeutico o di progettazione. Quindi, lo sviluppo di metodi per sondare questa interazione potrebbe essere utile. Più recenti progressi della fluorofori sviluppo 1-3 e tecnologia di imaging 4 può essere sfruttato per migliorare le nostre attuali conoscenze sulla patogenesi dengue e quindi aprire la strada per ridurre i milioni di dengue che si verificano ogni anno. Il virus dengue ha un involucro esterno costituito da un&#39;impalcatura di 90 busta glicoproteina (E) dimeri che proteggono il serbatoio nucleocapside, che contiene un singolo filamento positivo di RNA del genoma 5. Le subunità proteiche identiche sulla superficie del virus può quindi essere etichettato con un colorante reattivo ammina e visualizzati tramite microscopia a immunofluorescenza. Qui, presentiamo un semplice metodo di etichettatura dei virus della dengue con Alexa Fluor succinimidile estere colorante sciolto direttamente in un buffer di bicarbonato di sodio che ha dato virus altamente vitali dopo etichettatura. Non esiste una procedura standardizzata per l&#39;etichettatura dei virus vivo e protocollo del produttore esistente per l&#39;etichettatura delle proteine ​​di solito richiede la ricostituzione di colorante in dimetilsolfossido. La presenza di dimetilsolfossido, anche in piccole quantità, in grado di bloccare l&#39;infezione produttiva da virus e anche indurre citotossicità delle cellule 6. L&#39;esclusione dell&#39;uso di dimetilsolfossido in questo protocollo così ridotto questa possibilità. Alexa Fluor coloranti hanno fotostabilità superiore ed è meno sensibile al pH rispetto ai coloranti comuni, come la fluoresceina e rodamina 2, che li rende ideali per gli studi sulla captazione cellulare e il trasporto endosomali del virus. La coniugazione di Alexa Fluor colorante non ha influenzato il riconoscimento dei virus della dengue etichettati da virus-specifici anticorpi ed i suoi recettori putativi in cellule ospiti 7. Questo metodo potrebbe avere applicazioni utili in studi virologici.

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Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

Approfittando dei progressi nello sviluppo fluoroforo e tecnologia di imaging, un metodo semplice di Alexa Fluor etichettatura dei virus dengue è stato ideato per visualizzare le prime interazioni tra virus e cellule.

Visualizzazione virus Dengue attraverso Alexa Fluor Etichettatura

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

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