Name: visualizing dengue virus through alexa fluor labeling
Uploaded: 2011-07-09T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pela National Medical Research Council, de Cingapura.

1. Alexa Fluor rotulagem de vírus da dengue <ol><li> Antes da reação de rotulagem, purificar o vírus da dengue com almofada de sacarose e preparar os reagentes e equipamentos necessários, conforme indicado no protocolo. </li><li> Prepare tampão de bicarbonato de sódio 0,2 M fresca, pH 8,5 (tampão de marcação), e 1,5 M tampão hidroxilamina, pH 8.3 (parar de reagente), pouco antes de rotulagem e filtro de esterilizar com filtros de seringa 0,2 Hm. </li><li> Diluir aproximadamente 3x10 8 unidades fo...

<ol>
	<li>Olenych, S. G., Claxton, N. S., Ottenberg, G. K. &. a. m. p. ;. a. m. p., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fluorescent+Protein+Color+Palette.">The Fluorescent Protein Color Palette.</a> Current Protocols in Cell Biology. 21.5, 1-34 (2007).</li><li>Panchuk-Voloshina, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alexa+dyes,+a+series+of+new+fluorescent+dyes+that+yield+exceptionally+bright,+photostable+conjugates.">Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates.</a> J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).</li><li>Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+fluorescent+protein+technology.">Advances in fluorescent protein technology.</a> J Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+use+of+fluorescent+protein+markers+in+living+cells.">Development and use of fluorescent protein markers in living cells.</a> Science. 300, 87-91 (2003).</li><li>Kuhn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+dengue+virus:+implications+for+flavivirus+organization,+maturation,+and+fusion.">Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion.</a> Cell. 108, 717-725 (2002).</li><li>Aguilar, J. S., Roy, D., Ghazal, P., Wagner, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimethyl+sulfoxide+blocks+herpes+simplex+virus-1+productive+infection+in+vitro+acting+at+different+stages+with+positive+cooperativity.+Application+of+micro-array+analysis.">Dimethyl sulfoxide blocks herpes simplex virus-1 productive infection in vitro acting at different stages with positive cooperativity. Application of micro-array analysis.</a> BMC Infect Dis. 2, 9-9 (2002).</li><li>Zhang, S. L., Tan, H. C., Hanson, B. J., Ooi, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+Alexa+Fluor+dye+labelling+of+dengue+virus.">A simple method for Alexa Fluor dye labelling of dengue virus.</a> J Virol Methods. 167, 172-177 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Alexa Fluor Succinimidyl Esters (Molecular Probes. , (2009).</li><li>Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+proteins+stained+by+Alexa+dyes.">Analysis of proteins stained by Alexa dyes.</a> Electrophoresis. 25, 779-784 (2004).</li><li>Freistadt, M. S., Eberle, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+poliovirus+for+flow+cytometric+cell+surface+binding+studies.">Fluorescent poliovirus for flow cytometric cell surface binding studies.</a> J Virol Methods. 134, 1-7 (2006).</li></ol>

Embora AF594 corante foi usado neste relatório, uma ampla gama de fluoróforos na succinimidyl Alexa Fluor ésteres série está disponível com a química rotulagem similar. Isso poderia estender a aplicação rotulagem além de imagens. Citometria de fluxo pode ser usado como uma alternativa para microscopia confocal para estimar o grau de rotulagem para os fluoróforos que pode ser animado e detectado pela máquina FACS. Corantes Alexa Fluor são pequenas moléculas que reagem com grupos...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> Bicarbonato de sódio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> Hidroxilamina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 159417 </td><td></td></tr><tr><td> Hidróxido de sódio </td><td> Merck </td><td> 106498 </td><td></td></tr><tr><td> AF594 ésteres succinimidyl </td><td> Sondas moleculares, Invitrogen </td><td> A20004 </td><td></td></tr><tr><td> PD-10 coluna </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0851-01 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H6147 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> M-199 </td><td> Invitrogen </td><td> 11150 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td><td></td></tr><tr><td> 4 bem-placa </td><td> Nunc </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Lamínulas </td><td> Einst </td><td> 0111520 </td><td></td></tr><tr><td> Lâmina de microscópio </td><td> Vela Marca </td><td> 7105 </td><td></td></tr><tr><td> 3H5 hibridoma </td><td> ATCC </td><td> HB46 </td><td></td></tr><tr><td> PBS 10x </td><td> 1 Base de Dados </td><td> BUF-2040-10X1L </td><td></td></tr><tr><td> Saponina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S4521 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7906 </td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de magnésio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2670 </td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de cálcio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3306 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehye </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 15,812-7 </td><td></td></tr><tr><td> Mowiol 4-88 </td><td> Calbiochem </td><td> 475904 </td><td></td></tr><tr><td> Dabco </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D27802 </td><td></td></tr><tr><td> Centrífuga de mesa </td><td> Eppendorf </td><td> 5424 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio confocal </td><td> Zeiss </td><td> LSM 710 </td><td></td></tr></tbody></table> Para preparar M-199 meio de crescimento, adicionar 50ml de FBS, 5 ml de piruvato de sódio e 5 ml de não-aminoácidos essenciais para 500ml de M-199, filtro estéril. Para preparar M-199 meio de manutenção, adicionar 15ml de FBS, 5 ml de piruvato de sódio e 5 ml de não-aminoácidos essenciais para 500ml de M-199, filtro estéril.

visualizing dengue virus through alexa fluor labeling

Os eventos iniciais na interação entre vírus e células podem ter profunda influência sobre o resultado da infecção. Determinar os fatores que influenciam essa interação pode levar a uma melhor compreensão da patogênese da doença e assim influenciar a vacina ou o projeto terapêutico. Assim, o desenvolvimento de métodos para investigar essa interação seria útil. Os recentes avanços na fluoróforos desenvolvimento 1-3 e tecnologia de imagem 4 pode ser explorada para melhorar o nosso conhecimento atual sobre a patogênese da dengue e assim pavimentar o caminho para reduzir os milhões de infecções por dengue ocorrem anualmente. O vírus da dengue envolvido tem um andaime externo composto de 90 glicoproteína do envelope (E) dímeros que protejam o reservatório nucleocapsídeo, que contém uma fita única de RNA positivo genoma 5. As subunidades idênticas de proteína na superfície do vírus pode assim ser rotulados com um corante reativo de amina e visualizados através de microscopia de imunofluorescência. Aqui, apresentamos um método simples de rotulagem do vírus da dengue com Alexa Fluor succinimidyl éster corante dissolvido diretamente em um buffer de bicarbonato de sódio que rendeu vírus altamente viável após rotulagem. Não existe um procedimento padronizado para a rotulagem de vírus vivo e protocolo do fabricante existente para a rotulagem de proteínas geralmente requer a reconstituição do corante em dimetilsulfóxido. A presença de dimetilsulfóxido, mesmo em quantidades mínimas, podem bloquear a infecção produtiva de vírus e também induzir citotoxicidade de 6 células. A exclusão do uso de dimetil sulfóxido neste protocolo, assim, reduzida essa possibilidade. Corantes Alexa Fluor têm fotoestabilidade superior e são menos sensíveis ao pH do que as tinturas comuns, como a fluoresceína e rodamina 2, tornando-as ideais para estudos sobre a absorção celular e transporte endossomal do vírus. A conjugação de Alexa Fluor tintura não afeta o reconhecimento do vírus da dengue rotulado por vírus específicos de anticorpos e seus supostos receptores em células hospedeiras 7. Esse método pode ter aplicações úteis em estudos virológicos.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling at JoVE.com

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

Aproveitando os avanços na fluoróforo desenvolvimento e tecnologia de imagem, um método simples de Alexa Fluor rotulagem de vírus da dengue foi planejado para visualizar a interação precoce entre vírus e células.

Visualizando Vírus da Dengue por meio Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Isolamento de neutrófilos e análise para determinar seu papel na linfoma sensibilidade das células a agentes terapêuticos

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Imunologia e Infecção

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Avaliação da eficácia e toxicidade de RNAs Segmentação HIV-1 Produção para uso em Gene ou Quimioterapia

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Salvamento e Caracterização do Vírus Recombinante de um Clone Infeccioso do Vírus do Novo Mundo Zika

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Visualizando o macrófago armadilhas extracelular usando microscopia Confocal

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A citometria de fluxo simples com base em ensaio para determinar In Vitro anticorpo dependente do realce do vírus da Dengue, usando soro convalescente vírus Zika

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Extração rápida, segura e simples Manual cabeceira de ácidos nucleicos para a detecção de vírus em amostras de sangue total

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

Dengue vírus RNA no sobrenadante de cultura de células infectadas por reação em cadeia da polimerase em tempo real de quantitativos de medição

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

Identificação de codificação e Classes de RNA não-codificante expressa em suínos, sangue total

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

A Murine Model of Dengue Virus-induced Acute Viral Encephalitis-like Disease

Um modelo murino da doença da encefalite viral aguda induzida pelo vírus da dengue

Dengue virus (DENV), an arthropod-borne virus transmitted by mosquitoes, may cause the severe disease known as dengue hemorrhagic fever, which is ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

Teste in vitro ELISA para avaliar a potência da vacina antirrábica

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...