Name: visualizing dengue virus through alexa fluor labeling
Uploaded: 2011-07-09T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling at JoVE.com

Эта работа финансируется Национальным Советом по медицинским исследованиям, Сингапур.

1. Alexa Fluor маркировки вируса денге <ol><li> Перед маркировки реакцию, очищают вируса денге с сахарозой подушки и подготовить необходимые реактивы и оборудование, как указано в протоколе. </li><li> Подготовка свежего 0,2 М буфере бикарбоната натрия, рН 8,5 (маркировка буфера), и 1,5 гидроксиламин буф?...

<ol>
	<li>Olenych, S. G., Claxton, N. S., Ottenberg, G. K. &. a. m. p. ;. a. m. p., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fluorescent+Protein+Color+Palette.">The Fluorescent Protein Color Palette.</a> Current Protocols in Cell Biology. 21.5, 1-34 (2007).</li><li>Panchuk-Voloshina, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alexa+dyes,+a+series+of+new+fluorescent+dyes+that+yield+exceptionally+bright,+photostable+conjugates.">Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates.</a> J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).</li><li>Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+fluorescent+protein+technology.">Advances in fluorescent protein technology.</a> J Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+use+of+fluorescent+protein+markers+in+living+cells.">Development and use of fluorescent protein markers in living cells.</a> Science. 300, 87-91 (2003).</li><li>Kuhn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+dengue+virus:+implications+for+flavivirus+organization,+maturation,+and+fusion.">Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion.</a> Cell. 108, 717-725 (2002).</li><li>Aguilar, J. S., Roy, D., Ghazal, P., Wagner, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimethyl+sulfoxide+blocks+herpes+simplex+virus-1+productive+infection+in+vitro+acting+at+different+stages+with+positive+cooperativity.+Application+of+micro-array+analysis.">Dimethyl sulfoxide blocks herpes simplex virus-1 productive infection in vitro acting at different stages with positive cooperativity. Application of micro-array analysis.</a> BMC Infect Dis. 2, 9-9 (2002).</li><li>Zhang, S. L., Tan, H. C., Hanson, B. J., Ooi, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+Alexa+Fluor+dye+labelling+of+dengue+virus.">A simple method for Alexa Fluor dye labelling of dengue virus.</a> J Virol Methods. 167, 172-177 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Alexa Fluor Succinimidyl Esters (Molecular Probes. , (2009).</li><li>Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+proteins+stained+by+Alexa+dyes.">Analysis of proteins stained by Alexa dyes.</a> Electrophoresis. 25, 779-784 (2004).</li><li>Freistadt, M. S., Eberle, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+poliovirus+for+flow+cytometric+cell+surface+binding+studies.">Fluorescent poliovirus for flow cytometric cell surface binding studies.</a> J Virol Methods. 134, 1-7 (2006).</li></ol>

Хотя AF594 красителем была использована в данном докладе, широкий спектр флуорофоров в Alexa Fluor серии сукцинимидил эфиры можно получить с аналогичными химии маркировки. Это могло бы расширить применение маркировки за пределы изображения. Проточная цитометрия может быть использован как а?...

<table border="1"><tbody><tr><th> Название реагента </th><th> Компания </th><th> Номер в каталоге </th><th> Комментарии (необязательно) </th></tr><tr><td> Бикарбонат натрия </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> Гидроксиламина </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 159417 </td><td></td></tr><tr><td> Едкий натр </td><td> Merck </td><td> 106498 </td><td></td></tr><tr><td> AF594 сукцинимидил эфиры </td><td> Молекулярные зонды, Invitrogen </td><td> A20004 </td><td></td></tr><tr><td> PD-10 колонке </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0851-01 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H6147 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> ЭДТА </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> M-199 </td><td> Invitrogen </td><td> 11150 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td><td></td></tr><tr><td> 4-луночного планшета </td><td> Nunc </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Покровные </td><td> Einst </td><td> 0111520 </td><td></td></tr><tr><td> Микроскоп слайд </td><td> Парус Марка </td><td> 7105 </td><td></td></tr><tr><td> 3H5 гибридомы </td><td> АТСС </td><td> HB46 </td><td></td></tr><tr><td> 10x PBS </td><td> Первые базы </td><td> BUF-2040-10X1L </td><td></td></tr><tr><td> Saponin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S4521 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7906 </td><td></td></tr><tr><td> Хлорид магния </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2670 </td><td></td></tr><tr><td> Хлорид кальция </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3306 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehye </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 15,812-7 </td><td></td></tr><tr><td> Mowiol 4-88 </td><td> Calbiochem </td><td> 475904 </td><td></td></tr><tr><td> DABCO </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D27802 </td><td></td></tr><tr><td> Настольная центрифуга </td><td> Эппендорф </td><td> 5424 </td><td></td></tr><tr><td> Конфокальной микроскопии </td><td> Zeiss </td><td> LSM 710 </td><td></td></tr></tbody></table> Для подготовки М-199 ростовой среды, добавьте 50 мл FBS, 5 мл пирувата натрия и 5 мл без незаменимых аминокислот в 500 мл М-199, стерильный фильтр. Для подготовки М-199 содержание среды, добавить 15 мл FBS, 5 мл пирувата натрия и 5 мл без незаменимых аминокислот в 500 мл М-199, стерильный фильтр.

visualizing dengue virus through alexa fluor labeling

Ранние события во взаимодействии вируса и клетки может иметь существенное влияние на исход инфекции. Определение факторов, влияющих на это взаимодействие может привести к более глубокому пониманию патогенеза заболевания и таким образом влиять на терапевтическую вакцину или дизайна. Таким образом, разработка методов для исследования этого взаимодействия было бы полезно. Последние достижения в области развития флуорофоров 1-3 и технологий визуализации 4 может быть использована для улучшения наших знаний о патогенезе лихорадки денге и тем самым проложить путь к снижению миллионов случаев инфекции денге, происходящих ежегодно. Окутанный вирус денге внешние строительные леса, состоящие из 90 гликопротеина оболочки (E) димеров защиты нуклеокапсида оболочку, которая содержит единственный положительный цепь РНК геном 5. Идентичных субъединиц белка на поверхности вируса, таким образом, быть помечены амин реактивных красителей и визуализируются через иммунофлуоресцентного микроскопии. Здесь мы приводим простой способ маркировки вируса денге с Alexa Fluor сукцинимидил эфир красителя растворенные непосредственно в буфере бикарбонат натрия, который дал высокую жизнеспособных вирусов после маркировки. Существует нет стандартной процедуры для маркировки живого вируса и протокол существующих производителя по маркировке белка обычно требует восстановления красителя в диметилсульфоксид. Наличие диметилсульфоксида, даже в ничтожно малых количествах, могут блокировать продуктивной инфекции вируса, а также побудить ячейки цитотоксичность 6. Исключение использование диметилсульфоксида в этом протоколе сводится такую ​​возможность. Alexa Fluor красители имеют более высокий фотостабильности и менее рН-чувствительной, чем общие красители, такие как флуоресцеина и родамина 2, что делает их идеальными для изучения клеточного поглощения и эндосом перевозки вируса. Сопряжение Alexa Fluor красителя не повлияло признание меченого вируса денге на вирус-специфических антител и его предполагаемым рецепторов в клетках хозяина 7. Этот метод может иметь полезные приложения в вирусологических исследований.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling at JoVE.com

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

Воспользовавшись достижениями в флуорофора развития и технологий визуализации, простой метод Alexa Fluor маркировки вируса денге была разработана для визуализации ранних взаимодействий между вирусом и клетки.

Визуализация вируса денге через Alexa Fluor маркировки

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Нейтрофильная Выделение и анализ для определения их роли в клеточной лимфомы чувствительность к терапевтических агентов

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Оценка эффективности и токсичности РНК Ориентация ВИЧ-1 Производство для использования в генной или терапии наркотиками

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Спасение и характеристика рекомбинантного вируса из нового мира Инфекционный клон вируса Зика

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Визуализация внеклеточного ловушки макрофагов с помощью конфокальной микроскопии

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Простой проточной цитометрии на основе анализа для определения в Vitro антитела зависит повышение вируса денге, с помощью вируса Зика выздоравливающих сыворотки

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Быстрый, безопасный и простой ручной прикроватные нуклеиновой кислоты извлечения для обнаружения вируса в пробах цельной крови

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

Измерения вирус денге РНК в надосадке культуры зараженных клеток в реальном времени количественные полимеразной цепной реакции

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

Идентификация и кодирования кодирование классы РНК выражена в свином цельной крови

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

A Murine Model of Dengue Virus-induced Acute Viral Encephalitis-like Disease

Модель Murine вируса денге-индуцированного Острый вирусный энцефалит-подобный заболевание

Dengue virus (DENV), an arthropod-borne virus transmitted by mosquitoes, may cause the severe disease known as dengue hemorrhagic fever, which is ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

В Vitro ELISA тест для оценки бешенства вакцины потенции

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...