Name: visualizing dengue virus through alexa fluor labeling
Uploaded: 2011-07-09T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling at JoVE.com

Detta arbete har finansierats av National Medical Research Council, Singapore.

1. Alexa Fluor märkning av denguefeber virus <ol><li> Innan märkning reaktionen, rena denguefeber virus med sackaros kudde och förbereda de nödvändiga reagenser och utrustning som anges i protokollet. </li><li> Bered en färsk 0,2 buffert bikarbonat, pH 8,5 (märkning buffert) och 1,5 M hydroxylamin buffert, pH 8,3 (stopp reagens), strax innan märkning och filter sterilisera med 0.2μm spruta filter. </li><li> Späd ca 3x10 8 plack bildas enheter (PFU) av renat denguefeber virus i 1 ml märkning buffe...

<ol>
	<li>Olenych, S. G., Claxton, N. S., Ottenberg, G. K. &. a. m. p. ;. a. m. p., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fluorescent+Protein+Color+Palette.">The Fluorescent Protein Color Palette.</a> Current Protocols in Cell Biology. 21.5, 1-34 (2007).</li><li>Panchuk-Voloshina, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alexa+dyes,+a+series+of+new+fluorescent+dyes+that+yield+exceptionally+bright,+photostable+conjugates.">Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates.</a> J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).</li><li>Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+fluorescent+protein+technology.">Advances in fluorescent protein technology.</a> J Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+use+of+fluorescent+protein+markers+in+living+cells.">Development and use of fluorescent protein markers in living cells.</a> Science. 300, 87-91 (2003).</li><li>Kuhn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+dengue+virus:+implications+for+flavivirus+organization,+maturation,+and+fusion.">Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion.</a> Cell. 108, 717-725 (2002).</li><li>Aguilar, J. S., Roy, D., Ghazal, P., Wagner, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimethyl+sulfoxide+blocks+herpes+simplex+virus-1+productive+infection+in+vitro+acting+at+different+stages+with+positive+cooperativity.+Application+of+micro-array+analysis.">Dimethyl sulfoxide blocks herpes simplex virus-1 productive infection in vitro acting at different stages with positive cooperativity. Application of micro-array analysis.</a> BMC Infect Dis. 2, 9-9 (2002).</li><li>Zhang, S. L., Tan, H. C., Hanson, B. J., Ooi, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+Alexa+Fluor+dye+labelling+of+dengue+virus.">A simple method for Alexa Fluor dye labelling of dengue virus.</a> J Virol Methods. 167, 172-177 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Alexa Fluor Succinimidyl Esters (Molecular Probes. , (2009).</li><li>Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+proteins+stained+by+Alexa+dyes.">Analysis of proteins stained by Alexa dyes.</a> Electrophoresis. 25, 779-784 (2004).</li><li>Freistadt, M. S., Eberle, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+poliovirus+for+flow+cytometric+cell+surface+binding+studies.">Fluorescent poliovirus for flow cytometric cell surface binding studies.</a> J Virol Methods. 134, 1-7 (2006).</li></ol>

Även AF594 färg har använts i denna rapport är ett brett spektrum av fluoroforer i Alexa Fluor succinimidyl estrar serie nu med liknande märkning kemi. Detta kan förlänga märkning ansökan bortom avbildning. Flödescytometri kan användas som ett alternativ till konfokalmikroskopi för att uppskatta graden av märkning för fluoroforer som kan vara upphetsad och upptäcks av FACS maskin. Alexa Fluor färgämnen är små molekyler som reagerar med fria aminogrupper, främst arginin oc...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagensets namn </th><th> Företag </th><th> Katalognummer </th><th> Kommentarer (frivilligt) </th></tr><tr><td> Natriumbikarbonat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> Hydroxylamin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 159.417 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumhydroxid </td><td> Merck </td><td> 106.498 </td><td></td></tr><tr><td> AF594 succinimidyl estrar </td><td> Molekylära sonder, Invitrogen </td><td> A20004 </td><td></td></tr><tr><td> PD-10 kolumnen </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0851-01 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H6147 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> M-199 </td><td> Invitrogen </td><td> 11.150 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td><td></td></tr><tr><td> 4-brunnar </td><td> Nunc </td><td> 176.740 </td><td></td></tr><tr><td> Täckglas </td><td> Einst </td><td> 0111520 </td><td></td></tr><tr><td> Objektglas </td><td> Sail Märke </td><td> 7105 </td><td></td></tr><tr><td> 3H5 hybridom </td><td> ATCC </td><td> HB46 </td><td></td></tr><tr><td> 10x PBS </td><td> 1:a Base </td><td> BUF-2040-10X1L </td><td></td></tr><tr><td> Saponin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S4521 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7906 </td><td></td></tr><tr><td> Magnesiumklorid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2670 </td><td></td></tr><tr><td> Kalciumklorid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3306 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehye </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 15,812-7 </td><td></td></tr><tr><td> Mowiol 4-88 </td><td> Calbiochem </td><td> 475.904 </td><td></td></tr><tr><td> Dabco </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D27802 </td><td></td></tr><tr><td> Tabletop centrifug </td><td> Eppendorf </td><td> 5424 </td><td></td></tr><tr><td> Konfokalmikroskop </td><td> Zeiss </td><td> LSM 710 </td><td></td></tr></tbody></table> För att förbereda M-199 odlingsmedium, tillsätt 50 ml av FBS, 5 ml natrium pyruvat och 5ml av icke-essentiella aminosyror till 500ml av M-199, sterila filter. För att förbereda M-199 underhåll medium, lägga 15ml av FBS, 5 ml natrium pyruvat och 5ml av icke-essentiella aminosyror till 500ml av M-199, sterila filter.

visualizing dengue virus through alexa fluor labeling

Den tidiga händelser i samspelet mellan virus och cell kan ha stor påverkan på resultatet av infektion. Att fastställa de faktorer som påverkar denna interaktion kan leda till ökad förståelse för sjukdomen patogenes och därmed påverka vaccin eller terapeutiska design. Därför skulle utvecklingen av metoder för att undersöka detta samspel vara användbart. Senaste framstegen inom fluoroforer utveckling 1-3 och bildteknik 4 kan utnyttjas för att förbättra vår nuvarande kunskap om denguefeber patogenes och därmed bana väg för att minska de miljontals denguefeber infektioner inträffar årligen. Den höljeförsedda denguefeber viruset har en extern schavotten bestående av 90 (E) kuvert glykoprotein dimerer skydda nukleokapsid skal, som innehåller ett enda positivt tråd RNA-genom 5. Den identiska protein subenheter på viruset ytan kan därmed märkas med en amin reaktiva färg-och visualiseras genom immunofluorescens mikroskopi. Här presenterar vi en enkel metod för märkning av denguefeber virus med Alexa Fluor succinimidyl ester färgen löses upp direkt i en bikarbonat buffert som gav mycket livskraftiga virus efter märkning. Det finns inget standardiserat förfarande för märkning av levande virus och befintliga tillverkarens protokoll för protein märkning krävs i allmänhet beredning av färg i dimetylsulfoxid. Förekomsten av dimetylsulfoxid, även i små mängder, kan blockera produktiv infektion av viruset och förmå cell cytotoxicitet 6. Undantaget för användning av dimetylsulfoxid i detta protokoll minskas alltså denna möjlighet. Alexa Fluor färgämnen har en överlägsen fotostabilitet och är mindre pH-känslig än vanliga färger, såsom fluorescein och Rhodamine 2, vilket gör dem idealiska för studier av cellulära upptag och endosomal transport av viruset. Den konjugering av Alexa Fluor färgämnet påverkade inte erkänna märkt denguefeber virus av virus-specifik antikropp och dess förmodade receptorer i värdceller 7. Denna metod kunde ha användbara program i virologiska studier.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling at JoVE.com

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

Dra nytta av de framsteg i fluoroforen utveckling och bildteknik, en enkel metod för Alexa Fluor märkning av denguefeber virus utformades för att visualisera det tidiga samspelet mellan virus och cell.

Visualisering Dengue genom Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering och analys för att fastställa deras roll i lymfom Cell Känslighet för terapeutiska medel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Utvärdering av effekt och toxicitet av RNA Targeting HIV-1-produktion för användning i Gene eller Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Räddning och karaktärisering av rekombinant virus från en ny världsinfektiös klon från Zika Virus

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Visualisera makrofag extracellulära fällor med konfokalmikroskopi

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

En enkel flödescytometri baserat test för att bestämma In Vitro antikropp beroende förbättring av denguefeber Virus använder Zika Virus konvalescent Serum

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Snabb, säker och enkel manuell sängkanten nukleinsyra extraktion för påvisande av Virus i helblod

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

Mäta denguefeber Virus RNA i kultur supernatanten av infekterade celler av realtid kvantitativa Polymerase Chain Reaction

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

Identifiering av kodning och icke-kodande RNA klasser uttryckta i svin helblod

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

A Murine Model of Dengue Virus-induced Acute Viral Encephalitis-like Disease

En murin modell av Dengue virus-inducerad akut viral encefalit-liknande sjukdom

Dengue virus (DENV), an arthropod-borne virus transmitted by mosquitoes, may cause the severe disease known as dengue hemorrhagic fever, which is ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

In Vitro ELISA Test för att utvärdera rabiesvaccin potens

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...