Name: dna methylation: bisulphite modification and analysis
Uploaded: 2011-10-21T13:00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis at JoVE.com

<ol>
	<li>Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands.">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 1827-1831 (1992).</li><li>Clark, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines.">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic. Acids. Res. 22, 2990-2997 (1994).</li><li>Grunau, C., Clark, S. J., Rosenthal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisulfite+genomic+sequencing:+systematic+investigation+of+critical+experimental+parameters.">Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters.</a> Nucleic. Acids. Res. 29, E65-E65 (2001).</li><li>Clark, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation:+bisulphite+modification+and+analysis.">DNA methylation: bisulphite modification and analysis.</a> Nat. Protoc. 1, 2353-2364 (2006).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

تحليل الحمض النووي مثلأيشن بواسطة التسلسل الجيني للحمض النووي bisulphite تحويل طريقة راسخة ومرنة تسهل تحديد وتقدير من الحامض النووي في قرار النوكليوتيدات واحد. ومع ذلك ، وتحويل bisulphite وتحليل لاحقة تعتمد على فرضية أنه قد تم تحويل الحمض النووي بشكل كامل مع كل السيتوزين unmethylated يجري deaminated إلى اليوراسيل وcytosines فقط ميثليته المتبقية من الامم المتحدة وعلى رد الفعل. إذا كان التحويل غير كاملة ، يمكن تنشأ مشاكل مع التحليل ، إذ يمكن تحويله cytosines unmethylated تفسير غير صحيح كما cytosines ميثليته. يمكن أن يكون الأمثل Bisulphite التحويل في مراحل مختلفة لتحقيق أقصى قدر نسبة التحويل. أن الحمض النووي لتحويلها بالكامل يجب أن يكون أول واحد الذين تقطعت بهم السبل بحيث يتعرضون للمخلفات السيتوزين bisulphite الأيونات. الخطوة الأولى ، تمسخ الحمض النووي ، أمر بالغ الأهمية ، ويمكن أن تكون مصدرا للتحويل الحمض النووي ناقصا إذا لم يتم التشويه والتحريف بشكل كامل. لضمانأن الحمض النووي هو التشويه والتحريف بشكل كامل من المهم أن رد فعل المعلمات بما في ذلك إزالة جميع البروتينات المرتبطة بها ، حسب تركيز الملح ، ودرجة حرارة الحضانة والوقت المناسب للحفاظ على الحمض النووي في التشكل الذين تقطعت بهم السبل واحدة. من المهم استخدام الطازجة 3M هيدروكسيد الصوديوم والسماح الوقت الكافي للحضانة. إذا كان الحمض النووي تقاوم تمسخ ، قد يكون بعض التعديلات على البروتوكول بما في ذلك تمديد فترة حضانة لمدة 30 دقيقة أو تفتيت الحمض النووي قبل تمسخ تسهيل تمسخ الحمض النووي. بالإضافة إلى ذلك ، قد تقطعت بهم السبل الحمض النووي واحد (ssDNA) إعادة يصلب لمضاعفة الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل (dsDNA) خلال رد فعل التحويل bisulphite. ويمكن تنفيذ رد فعل على ارتفاع درجة الحرارة (90-95 درجة مئوية) إما بصورة دورية أو مستمرة خلال تفاعل bisulphite المساعدات صون ssDNA. ومع ذلك ، فإنه من المهم أن ندرك أن يتم تسريعها تدهور الحمض النووي في ارتفاع درجات الحرارة هذه. ويمكن أيضا الكواشف المختلفة يمكن ان تضاف الى عرقلة إعادة الصلب من الجدائل الحمض النووي ه ، مثل اليوريا. يمكن للتركيز الحمض النووي ونوعيته يؤثر أيضا على كفاءة التفاعل bisulphite والعائد النهائي PCR. تدهور الحمض النووي هو وجود قيود على تحويل بروتوكول bisulphite. العلاج الكيميائي للفواصل حبلا الحمض النووي يدخل في مختلف ssDNA وبعض الظروف القاسية اللازمة لتحويل bisulphite كاملة بما في ذلك تركيز عالية bisulphite مرات حضانة طويلة يمكن أن يسرع تدهور الحمض النووي. وفقا للشروط القياسية وصف رد الفعل ، وتدهور الحمض النووي ليست مشكلة شائعة ولكن ، إذا أدخلت تعديلات البروتوكول ، مثل متواليات التي يتم صهر للتحويل ، لقوالب الحمض النووي التي تدهورت أو من نوعية رديئة مثل عينات FFPE ، ثم تدهور الحمض النووي يمكن أن يصبح وجود قيود كبيرة. يمكن الفورمالين الثابتة ، جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE) وعينات من الحمض النووي المتدهورة على نحو فعال وتضخيم bisulphite تحويلها باستخدام هذا البروتوكولولكن ينصح التعديلات للتأكد من أن الحمض النووي لا مزيد من التدهور. ينصح استخدام الحمض النووي الريبي الناقل مثل الحمض النووي الريبي ر. ويمكن أيضا أن يضاف الجليكوجين باعتبارها الناقل عند تركيز منخفض الحمض النووي (&lt;200 نانوغرام). لأن الحمض النووي من الأنسجة المعزولة FFPE بالفعل مجزأة ومزيد من الانقسام يحدث أثناء نزع الأمين ، يجب الحرص على الحد من مزيد من التدهور. لا مزيد من الحمض النووي قبل أي جزء تمسخ والحد من فترة حضانة للتفاعل bisulphite إلى 4 ساعات. تصميم amplicons لم أكبر من 300 سنة مضت بسبب الحمض النووي مجزأة. عامل آخر يمكن أن تؤثر على تضخيم PCR أن التحويل من bisulphite cytosines unmethylated يقلل من تعقيد قالب الحمض النووي. ويمكن تصميم التمهيدي بعد بروتوكول المبينة في القسم 4.1 ، زيادة طول التمهيدي وPCR المتداخلة مساعدة جميع لزيادة الغلة والنوعية PCR. أخيرا ، منذ القالب الحمض النووي هو تغيير خلال bisulphويمكن تحويل الفنار ، والتحيز التضخيم تكون مصدرا للقلق. ضمان أن يتم فحص PCR التضخيم النسبي من القوالب وميثليته unmethylated مع مزيج 50/50 سيطرة الحمض النووي M / U ، كما ورد في البروتوكول ، انظر الشكل 3. تأكد أيضا أن التضخيم من القوالب تحويلها فقط يحدث باستخدام انزيم HpaIII التقييد والكهربائي للهلام (الشكل 3). قد تحتاج إلى ظروف PCR يكون الأمثل من خلال تغيير درجة الحرارة وتركيز / أو المغنيسيوم أو إطالة وقت التمديد. بعض القوالب ويبدو أن مشكلة خاصة وموقف التمهيدي قد تحتاج إلى أن تعدل أو تتحول الاشعال قد تحتاج لاستخدامه. تقنيات الجيل القادم التسلسل تتطور بسرعة لتحقيق تسوية مماثلة لتسلسل الجينوم bisulphite ، وثالث التسلسل جيل جزيء واحد لديه القدرة على السماح لتحليل الحمض النووي لكل من الابتدائي ومثيلة من دون الحاجة إلى تسلسل bisulphite. ومع ذلك ، وتوافر واسع النطاق والمواصفاتificity من هذه التقنيات لا تزال بعض الوقت بعيدا. تسلسل الجينوم Bisulphite هو معيار الذهب في التحليل ومثلأيشن هو بروتوكول قوية. وقد أحرز تقدم في طريقة إلى النقطة التي تم فيها حل المشاكل المشتركة والقيود والطلبات قد وسعت من التحليلات الجينية الفردية إلى إنتاجية عالية وتحليل كامل الجينوم التي وصفها كلارك وآخرون 4 2006. وترد المبادئ التوجيهية والتوصيات لحل المشاكل إضافية في الجدول رقم 1. يقترح أن النهج الأمثل هو اتباع البروتوكول القياسي في البداية فقط وإدخال التعديل إذا وعندما تنشأ مشكلة. <img src="/files/ftp_upload/3170/3170table2.jpg" alt="الجدول 2" /> الجدول 1. المبادئ التوجيهية استكشاف

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Metabisulphite الصوديوم (اياكس Finechem) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هيدروكينون (ميرك) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحمض النووي المعالج تنظيف النظام (Promega) </li></ol>

dna methylation: bisulphite modification and analysis

علم التخلق يصف التغيرات في وظيفة الجينات الموروثة التي تحدث بشكل مستقل لتسلسل الحمض النووي. الأساس الجزيئي للتنظيم الجينات جينية معقدة ، ولكن ينطوي أساسا تعديلات على الحمض النووي أو البروتينات نفسها التي الحمض النووي الزميلة. التعديل اللاجينية الغالبة من الحمض النووي في جينومات الثدييات هي مثيلة من النيوكليوتيدات السيتوزين (5 - MEC). الحامض النووي يوفر التعليم لآلية التعبير الجيني إلى أين ومتى ينبغي التعبير عن الجين. والهدف الرئيسي لتسلسل الحامض النووي في الثدييات هو 5&#39; - CPG - 3 &#39;dinucleotides (الشكل 1). لا dinucleotides CPG موزعة بشكل متجانس في جميع أنحاء الجينوم ، ولكنها تتركز في مناطق تسلسل الجينوم المتكررة وCPG &quot;الجزر&quot; التي ترتبط عادة مع المروجين الجين (الشكل 1). وتنشأ أنماط الحامض النووي في وقت مبكر في عملية التنمية ، التضمين أثناء تمايز أنسجة محددة وتعطلت في دول كثيرة من بينها مرض السرطان. إلى شمطلوبة nderstand الدور البيولوجي في الحامض النووي ودورها في المرض ، والإنسان الدقيق وفعالة وقابلة للتكرار الأساليب لكشف وتحديد الفرد 5 MeCs. هذا البروتوكول لتحويل bisulphite هو &quot;المعيار الذهبي&quot; لتحليل الحامض النووي ويسهل تحديد وتقدير من الحامض النووي في قرار النوكليوتيدات واحد. كيمياء نزع الأمين السيتوزين bisulphite الصوديوم التي تتضمن ثلاث خطوات (الشكل 2). (1) Sulphonation : إضافة إلى السندات bisulphite 5-6 المزدوج لنزع الأمين (2) السيتوزين الهيدروليكية : نزع الأمين حلمهي المشتقة السيتوزين ، مما أدى إلى إعطاء bisulphite مشتق اليوراسيل - bisulphite (3) Desulphonation قلوي : إزالة للسلفونات المجموعة علاج القلوية ، لإعطاء اليوراسيل. Bisulphite deaminates تفضيلي السيتوزين إلى اليوراسيل في الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل واحد ، في حين MEC - 5 ، هو صهر لbisulphite بوساطة نزع الأمين. على تضخيم PCR ، يتم تضخيمه اليوراسيلكما الثايمين بينما 5 - MEC مخلفات تبقى كما cytosines ، مما يسمح حاليا CpGs ميثليته من CpGs unmethylated بواسطة جود &quot;جيم&quot; السيتوزين مقابل بقايا الثايمين &quot;T&quot; خلال التسلسل. تعديل الحمض النووي عن طريق تحويل bisulphite هو بروتوكول الراسخة التي يمكن استغلالها لطرق كثيرة للتحليل الحامض النووي. وقد تجلى منذ أول اكتشاف MEC - 5 عن طريق التحويل بواسطة bisulphite فرومر وآخرون (1) وكلارك وآخرون. 2 ، وطرق التحويل القائمة حول bisulphite حساب الحمض النووي الجيني لغالبية بيانات جديدة عن الحامض النووي. يمكن استخدام أساليب مختلفة للتحليل PCR آخر ، اعتمادا على درجة من الدقة وحلها مثلأيشن المطلوبة. الاستنساخ والتسلسل لا يزال الأسلوب الأكثر توافرا التي يمكن أن تعطي واحدة لقرار النوكليوتيدات مثيلة عبر جزيء الحمض النووي.

Watch this Scientific Journal Video about DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis at JoVE.com

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

المعيار الذهبي لتحليل الحامض النووي هو التسلسل الجيني للbisulphite الحمض النووي التي تم تحويلها. هذا الأسلوب يستفيد من زيادة الحساسية للمقارنة مع السيتوزين methylcytosine - 5 (5 - MEC) إلى نزع الأمين bisulphite تحت الظروف الحمضية. ويمكن تمييز cytosines Unmethylated من cytosines ميثليته بعد التضخيم PCR هدف الحمض النووي الجيني.

الحامض النووي : Bisulphite تعديل وتحليل

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

Research

JoVE Journal

Biology

PDMS Device Fabrication and Surface Modification

PDMS تصنيع الأجهزة وتعديل السطح

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

والخلايا العصبية ونجمية المشارك الثقافة الفحص لتحليل محتوى عال من العصبية

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

تقرير من الحامض النووي من الجينات في مطبوع Arabidopsis السويداء

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

تعديل وإعادة التركيب الوراثي للاللعابية الثقافات الجهاز الغدة

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

وسيلة فعالة للالكمي، التحليل خلية واحدة من لونين تعديل والعمارة النووية في جبل لالجامع بويضات في<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

التصوير في الوقت الحقيقي من واحدة المهندسة رنا النصوص في الخلايا الحية عن طريق Ratiometric ثنائي الجزيء منارات

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

انخفاض الجاذبية المظاهرات الأجهزة البيئة في نموذج المنمنمة تدفق عداد الكريات ورفيق ميكروفلويديك تقنية خلط

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

في المختبر مثلأيشن الفحص لدراسة البروتين أرجينين مثلأيشن

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

المحسن انخفاض التمثيل بيسلفيت تسلسل لتقييم الحامض النووي في قرار قاعدة زوج

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

ربط الجينات المحددة الحامض النووي التغييرات مع التعبير والترانسكربتي آخر من نجمي<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a ...