Name: dna methylation: bisulphite modification and analysis
Uploaded: 2011-10-21T13:00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis at JoVE.com

<ol>
	<li>Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands.">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 1827-1831 (1992).</li><li>Clark, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines.">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic. Acids. Res. 22, 2990-2997 (1994).</li><li>Grunau, C., Clark, S. J., Rosenthal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisulfite+genomic+sequencing:+systematic+investigation+of+critical+experimental+parameters.">Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters.</a> Nucleic. Acids. Res. 29, E65-E65 (2001).</li><li>Clark, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation:+bisulphite+modification+and+analysis.">DNA methylation: bisulphite modification and analysis.</a> Nat. Protoc. 1, 2353-2364 (2006).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Метилирования ДНК анализ геномной последовательности бисульфита преобразованы ДНК является хорошо организованной и универсальный метод, который облегчает идентификацию и количественное определение метилирования ДНК в одиночных нуклеотидных разрешения. Тем не менее, бисульфит преобразования и последующий анализ основан на той посылке, что ДНК была полностью преобразована с каждым неметилированный цитозин быть дезаминироваться в урацил и только метилированных цитозина оставшиеся не-реактивным. Если преобразование является неполным, проблемы могут возникнуть с анализа, так как необращенных неметилированный цитозина могут быть неправильно интерпретированы как метилированных цитозина. Бисульфита преобразования могут быть оптимизированы на различных этапах, чтобы максимизировать процент конверсии. Для ДНК, чтобы быть полностью преобразовал его в первую очередь должны быть одноцепочечной, так что цитозин остатки подвергаются бисульфита ионов. Первый шаг, ДНК денатурации, является критическим и может быть источником неполного преобразования, если ДНК не полностью денатурированный. Для обеспечениячто ДНК полностью денатурированным важно, чтобы реакция параметров, включая удаление всех связанных с белком, соответствующей концентрации соли, температуры инкубации и время подходит для сохранения ДНК в одноцепочечной конформации. Важно использовать свежие 3М NaOH и обеспечивать достаточное время инкубации. Если ДНК сопротивляется денатурации, некоторые изменения в протокол включая расширение инкубационный период до 30 минут или фрагментации ДНК до денатурации ДНК может способствовать денатурации. Кроме того, одноцепочечной ДНК (оцДНК) может повторно отжига в двухцепочечной ДНК (дц) во время бисульфит реакции конверсии. Проведение реакции при высокой температуре (90-95 ° С), либо периодически, либо непрерывно в течение бисульфит реакции может помочь поддержанию оцДНК. Тем не менее, важно помнить, что ДНК деградации значительно ускоряется при таких высоких температурах. Различные реагенты могут быть также добавлены сорвать повторного отжига йэлектронных цепей ДНК, такие как мочевина. Концентрация ДНК и ее качество также может влиять на эффективность бисульфит реакции и конечная доходность ПЦР. ДНК деградация ограничение бисульфита преобразования протоколов. Химической обработки ДНК знакомит с различными разрывов ДНК в оцДНК и некоторые из суровых условий, необходимых для полного преобразования бисульфита в том числе высокой концентрацией бисульфит, долгое время инкубации может ускорить деградацию ДНК. При стандартных условиях реакции описаны, ДНК деградация не является общей проблемой, однако, если протокол изменения вводятся, например, для последовательности, которые поддаются преобразования, для ДНК-шаблоны, которые разлагаются или низкого качества, такие как FFPE образцы, то деградация ДНК может стать существенным ограничением. Фиксированные в формалине, парафин (FFPE) и деградированных образцов ДНК может быть эффективно преобразовано бисульфита и усиливаются с помощью этого протоколаОднако изменения для того, чтобы ДНК не является дальнейшее деградированных рекомендуется. Использование носителя РНК, такие как трет РНК рекомендуется. Также гликогена может быть добавлен в качестве носителя, когда ДНК низкой концентрации (&lt;200 нг). Поскольку ДНК, выделенной из тканей FFPE уже фрагментированы и дальнейшей фрагментации происходит во время дезаминирования, необходимо позаботиться, чтобы минимизировать дальнейшей деградации. Не фрагмента ДНК дальнейшее до денатурации и ограничить время инкубации для бисульфит реакции до 4 часов. Дизайн ампликонов не больше, чем на 300 б.п. за счет фрагментированной ДНК. Другим фактором, который может влиять на ПЦР-амплификации, что бисульфит преобразования неметилированный цитозина уменьшает сложность ДНК. Следующий протокол дизайн грунтовки, изложенным в разделе 4.1, увеличение длины праймеров и ПЦР все это может способствовать увеличению специфичности ПЦР и доходности. Наконец, поскольку ДНК-шаблон меняется в течение bisulphITE преобразования, усиления смещения может быть проблемой. Убедитесь, что пропорциональная ПЦР-амплификации метилированной и неметилированный шаблонов проверяется с контролем 50/50 M / U смесь ДНК, как указано в протоколе, см. рис 3. Также убедитесь, что усиление только преобразуется Шаблоны происходит HpaIII использованием ферментов рестрикции и гель-электрофореза (рис. 3). Условия ПЦР, возможно, должны быть оптимизированы путем изменения температуры и / или магния, концентрация или удлинение расширение времени. Некоторые шаблоны кажутся особенно проблематичным и грунтовки позиции, возможно, должны быть скорректированы или вырожденные праймеры, возможно, должны быть использованы. Следующая методы секвенирования поколения стремительно развивается, чтобы достичь аналогичной резолюции в бисульфит геномной последовательности, и третье поколение одной последовательности молекулы имеет потенциал, чтобы обеспечить анализ как первичного, так и метилирования ДНК без необходимости бисульфита секвенирования. Тем не менее, широкую доступность и спецификацииificity из этих методов остается какое-то время далеко. Бисульфита секвенирования генома является золотым стандартом в метилирования анализа и надежный протокол. Метод прогрессировала до такой степени, общие проблемы и ограничения были решены, и приложения расширили отдельных анализ гена высокой пропускной способности и весь анализ генома описывается Clark и соавт. 2006 4. Поиск и устранение неисправностей руководящие принципы и дополнительные рекомендации приведены в Таблице 1. Предполагается, что оптимальный подход заключается в изначально следовать стандартным протоколом, и только ввести модификации, если и когда возникает проблема. <img src="/files/ftp_upload/3170/3170table2.jpg" alt="Таблица 2" /> Таблица 1. Устранение неполадок Руководство

<ol><li> Метабисульфит натрия (Ajax Finechem) </li><li> Гидрохинон (Merck) </li><li> Мастер ДНК-очистку системы (Promega) </li></ol>

dna methylation: bisulphite modification and analysis

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene regulation is complex, but essentially involves modifications to the DNA itself or the proteins with which DNA associates. The predominant epigenetic modification of DNA in mammalian genomes is methylation of cytosine nucleotides (5-MeC). DNA methylation provides instruction to gene expression machinery as to where and when the gene should be expressed. The primary target sequence for DNA methylation in mammals is 5'-CpG-3' dinucleotides (Figure 1). CpG dinucleotides are not uniformly distributed throughout the genome, but are concentrated in regions of repetitive genomic sequences and CpG "islands" commonly associated with gene promoters (Figure 1). DNA methylation patterns are established early in development, modulated during tissue specific differentiation and disrupted in many disease states including cancer. To understand the biological role of DNA methylation and its role in human disease, precise, efficient and reproducible methods are required to detect and quantify individual 5-MeCs.
This protocol for bisulphite conversion is the "gold standard" for DNA methylation analysis and facilitates identification and quantification of DNA methylation at single nucleotide resolution. The chemistry of cytosine deamination by sodium bisulphite involves three steps (Figure 2). (1) Sulphonation: The addition of bisulphite to the 5-6 double bond of cytosine (2) Hydrolic Deamination: hydrolytic deamination of the resulting cytosine-bisulphite derivative to give a uracil-bisulphite derivative (3) Alkali Desulphonation: Removal of the sulphonate group by an alkali treatment, to give uracil. Bisulphite preferentially deaminates cytosine to uracil in single stranded DNA, whereas 5-MeC, is refractory to bisulphite-mediated deamination. Upon PCR amplification, uracil is amplified as thymine while 5-MeC residues remain as cytosines, allowing methylated CpGs to be distinguished from unmethylated CpGs by presence of a cytosine "C" versus thymine "T" residue during sequencing.
DNA modification by bisulphite conversion is a well-established protocol that can be exploited for many methods of DNA methylation analysis. Since the detection of 5-MeC by bisulphite conversion was first demonstrated by Frommer et al.1 and Clark et al.2, methods based around bisulphite conversion of genomic DNA account for the majority of new data on DNA methylation. Different methods of post PCR analysis may be utilized, depending on the degree of specificity and resolution of methylation required. Cloning and sequencing is still the most readily available method that can give single nucleotide resolution for methylation across the DNA molecule.

Watch this Scientific Journal Video about DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis at JoVE.com

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

Золотым стандартом для анализа ДНК метилирования геномной последовательности бисульфита преобразованы ДНК. Этот метод использует преимущества повышенной чувствительности цитозина по сравнению с 5-метилцитозин (5-MEC), чтобы бисульфита дезаминирования в кислой среде. Неметилированный цитозина можно отличить от метилированных цитозина после ПЦР-амплификации геномной ДНК мишени.

Метилирования ДНК: Модификация бисульфита и анализа

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

Research

JoVE Journal

Biology

PDMS Device Fabrication and Surface Modification

PDMS изготовление устройств и модификации поверхности

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Нейронов и астроцитов сотрудничеству культуры Пробирной высоких Анализ содержания Нейротоксичность

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Определение ДНК Метилирование запечатлены в генах Arabidopsis Эндосперм

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Генетическая модификация и рекомбинации слюнных желез органной культуры

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

Эффективный метод для количественного, анализа одноклеточные хроматина Модификация и ядерной архитектуры в целом монтажа яйцеклеток в<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

В режиме реального времени изображений Единого Engineered РНК-транскриптов в живых клетках, используя Логометрический Бимолекулярные маяки

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Сниженной гравитационные окружающей среды и комплектующие Демонстрации проточной цитометрии и Companion микрожидкостных Технология смешивания Прототип миниатюрных

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

В пробирке метилирования Пробирной по изучению белка аргинин метилирования

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

Enhanced приведенного представления Бисульфитное секвенирование по оценке метилирования ДНК в паре оснований резолюции

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

Соотнося геноспецифических метилирования ДНК изменения с выражением и транскрипционной активности астроцитарных<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a ...