Name: cut-loading: a useful tool for examining the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons
Uploaded: 2012-01-12T12:00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons at JoVE.com

עבודה זו מומנה על ידי NIH כדי להעניק EY005102 SCM ו EY018640 כדי החייאה

1. אינטקט הרשתית ההכנות העצבי, עכברים וארנבים דג זהב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את כל הפעולות הבאות, לרבות אלה שתוארו &quot;טעינת-Cut 2),&quot; תחת תאורה קבועה (רקע) הסביבה. שים לב למטרות פרוטוקול זה, ההליכים המתוארים ביצע כמו בחושך תמידי (כלומר תחת כהה מאוד (כלומר &quot;scotopic&quot;) בתנאים ≤ 0.0001 לוקס) באמצעות משקפי אינפרא אדום לראיית לילה, אבל אחר רמות גבוהות יותר של עוצמת תאורה מפוזרת מתמיד ניתן להשתמש במקום כדי לקבוע את ההשפעה של רמות אחרות של תאורה מפוזרת על צימוד צומת הפער נותב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dark-להתאים את הניסוי בבעלי חיים (, דג זהב העכבר או ארנבת) במשך שעה לפחות 1 לפני הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפי שתואר קודם לכן 7, עמוק להרדים דגי זהב על ידי הצבת אותם tricaine methanesulfonate (MS222: 150 מ&quot;ג / ליטר של מים שנאגרו (סודיום ביקרבונט המכילים) אקווריום), עמוק להרדים עכברים עם קטמין (100 מ&quot;ג/ Kg, ip) ו rompun (10 מ&quot;ג / ק&quot;ג, ip). עמוק להרדים ארנבות עם urethane (טעינת מנה: 2.0 גרם / ק&quot;ג, ip) וגם להשתמש בהרדמה מקומית intraorbital (2% Xylocaine), כפי שתואר לעיל 8. כל הליכי הניסוי לערב את הטיפול והשימוש בבעלי חיים צריכה להתבצע בהתאם להנחיות הפדרלי להיות נבדקה ואושרה על ידי טיפול בבעלי חיים באוניברסיטה המקומית וועדות להשתמש. (הערה:. בניסויים המתוארים כאן, כל הפרוצדורות הכרוכות בטיפול ושימוש דגים, עכברים וארנבים בוצעו בהתאם להנחיות NIH והיו נבדקה ואושרה על ידי אוניברסיטת אוהיו Animal Care מדינת מוסדיים ועדת שימוש) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכן, עכברים דגים וארנבות, בעקבות enucleation, להסיר את החלק הקדמי של גלגל העין לכל. ואז, במקום פיסת נייר פילטר על גבי החלק האחורי של העין להפוך את הנייר עין לסנן, כך נייר מסנן מתחת לחלק האחורי של העין. לאחר מכן, באמצעות קנסמלקחיים לנתח את הרשתית העצבית ללא פגע מן החלק האחורי של העין על ידי בעדינות קילוף האפיתל פיגמנט / דמית העין / בלובן העין, אשר מחוברים זה לזה, מן הרשתית העצבית, המצורף לעיתון הסינון. כפי שזה נעשה, לחתוך את עצב הראייה באמצעות קנס קפיץ מספריים. הרשתית העצבית, את מכוונת photoreceptor בצד, צריך עכשיו להיות מחוברים הנייר לסנן מופרדים משאר העין. </li></ol> 2. Cut-loading <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע את הרשתיות בתמיסת רינגר של חמצן (טבלה 1) בצלחת 6-באר (~ 5 מ&quot;ל / היטב) למשך 30 דקות תחת קבוע הסביבה (רקע) תאורה (למשל תחת (כלומר &quot;scotopic&quot;) בתנאים כהה מאוד) עם או בלי תרופה הבדיקה. שמור על הרשתית דגים מחומצן (5 CO% 2 / 95% O 2) ביקרבונט מבוססי Ringer של ב 22 ° C על ידי איטום צלחת 6-היטב עם parafilm ולשמור הרשתיות עכבר ארנב ב 36 מעלות צלזיוס CO 5% 2 / 95% O <sub&gt; 2 באינקובטור. כאשר תרופה המבחן משמש, זה צריך להיות נוכח במהלך כל הצעדים הבאים, עד קיבעון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון נותב (בדרך כלל 100 μL) על ידי המסת neurobiotin (0.5%), מולקולה biotinylated, בתמיסה של Ringer מיד לפני חיתוך דרך הרשתית. שים לב כי 0.5% rhodamine dextran (גבוה (&gt; 10000) MW) ניתן להוסיף את הפתרון. בשל משקל מולקולרי גבוה, rhodamine dextran לא לחצות צמתים הפער רק תוויות תאים שניזוקו על ידי החתך. כפי שמוצג באיור. 3, זו דרך יעילה להבחין בין תאים שהצטברו neurobiotin כי הם נפגעו, מאלו צברו נותב על ידי דיפוזיה דרך צמתים הפער. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את פתרון neurobiotin על זכוכית (או פלסטיק) צלחת פטרי, הקש על נייר פילטר, שאליו מחוברת הרשתית, על מגבת נייר כדי להסיר עודפי רינגר, לטבול סכין גילוח (או סכין חדה אחרת) בפתרון neurobiotin וn לבצע חתך רדיאלי דרך הרשתית נייר פילטר. אם העדיף, מפרידי ניתן להשתמש כדי לחתוך נעשית דרך הרשתית, אבל לא את נייר הסינון. לחתוך צריכה להיות מכוונת בניצב לפני השטח הרשתית. טובלים את הסכין בפתרון neurobiotin שוב לחתוך את הרשתית בפעם השנייה. חזור על פעולה זו עד 4 חתכים לכל הרשתית (ראה איור. 1). השתמש במיקרוסקופ לנתח בעת ביצוע חתכים גילוח באמצעות העכבר הרשתיות קטנים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפי שמוצג באיור. 1, להטביע את הרשתית שוב בינוני Ringer של טרי, עם או בלי סמים הבדיקה, באמצעות 6-צלחת היטב (5 מ&quot;ל רינגר / טוב). דגירה הרשתית במשך 15 דקות, כדי לאפשר טעינה דיפוזיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם בינוני Ringer של טרי עם או בלי סמים הבדיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את הרשתית עם paraformaldehyde 4% ב 0.1 M פוספט חיץ (PBS, pH 7.4) במשך שעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם 0.1 מ PBS לילה בשעה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להגיב with 2% streptavidin-Alexa 488 (ריכוז סופי 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ב 0.1M PBS + 0.3% טריטון X-100, ולשמור לילה בשעה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד עם 0.1M PBS ב RT </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב-PBS, ולנתק את הרשתית מנייר מסנן ולאחר מכן, בעזרת מברשת בסדר, המקום הרשתית, מעלה בכיוון photoreceptor בצד, על גבי שקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לעלות עם הרכבה בינונית Vectashield (וקטור מעבדות, Burlingame, CA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלמו תמונות עם לייזר סריקת מיקרוסקופ confocal (למשל Zeiss 510 META) בשעה אותה רזולוציה הגדלה, והגדרות עבור כל תנאי הניסוי, כך שניתן להשוות את ההשפעות של תנאי הניסוי השונים (למשל תרופות הבדיקה; תנאי תאורה) על היקף הפער צומת נותב צימוד (איור 2A-C ו איור. 4A-C). אמנם תמונה אחת עשויה להכיל כל התאים שכותרתו, מומלץ לך לאסוף ערימה של Z-שטח של עניין ולכווץ אותו יחידהתמונה. </li></ol> 3. כימות צימוד נותב באמצעות ImageJ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדפדפן תמונה LSM, לפתוח את התמונה, לחץ על ייצוא ולשמור את התמונה קצת TIF-16 לא דחוס הקובץ. סרגל קנה מידה יש ​​לכלול תמונה TIF זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תוכנה NIH ImageJ, למדוד עוצמת הקרינה של neurobiotin Alexa-488 שכותרתו מן הגדלה נמוכה תמונות של כל הר הרשתיות. פתח את הקובץ TIF באמצעות תוכנת ImageJ ואז לצייר קו ישר המקביל לסרגל סולם. עבור נתח, SET SCALE ולהזין את המרחק ידוע יחידת אורך, ולחץ על אישור. עכשיו תוצאות המדידה יכול להיות מוצג ביחידות מכויל, כגון מילימטרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את אזור עניין באמצעות הכלי בחירה מלבני. השיא של הקרינה צריך להיות מוצב על הגבול השמאלי של הבחירה שלך. ודא כי אין אות הקרינה ליד הגבול הנכון. אם לא, לסובב את התמונה פעיל (תמונה, ולאחר מכן סובב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץנתח ו PLOT פרופיל. אתה צריך לראות את עקומת עם דעיכה מעריכית משמאל לימין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על העתק בחלון הקופץ ולהדביק אותו ב-Excel. עכשיו אתם רואים שתי עמודות המראה את המרחק בין החתך (בעמודה השמאלית) ואת עוצמת הקרינה כפונקציה של המרחק לחתוך את (בעמודה הימנית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים כל ערך הקרינה גלם על ידי ערך הקרינה המרבית כדי להשיג את עוצמת הקרינה יחסית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העתקת שתי עמודות המתאים המרחק לחתוך את (X) לבין עוצמת הקרינה היחסית (Y), ולאחר מכן להדביק אותם לתוך תוכנת מקור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Fit עם הדעיכה המעריכית # 1 פונקציה (איור 2 ד ו איור 4D.), אשר היא בצורה: Y = 0 Y + Y מקסימום * exp (-x / λ) היכן Y הוא עוצמת הקרינה היחסית, Y o היא הקרינה רקע, Y מקסימום היא הקרינה היחסית המקסימלית, λ הוא spאס (אורך) קבוע, ו-x הוא המרחק בין החתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השווה החלל קבוע (λ) ערכים על תנאי הניסוי השונים באמצעות מבחן t או ANOVA (2E איור איור ו. 4E). שים לב טכניקות חלופיות כימות תוארו על ידי אחרים 13,14. </li></ol> 4. נציג תוצאות דוגמאות מייצגות של נותב תא photoreceptor צימוד כפי שנקבע על ידי טעינת לחתוך מוצגים איורים 2 ו 3 (דגים) ו איור 4 (ארנבת). התמונות צולמו באמצעות Confocal באותן הגדרות להשוואה (איור 2A-C ו איור. 4A-C) את עוצמת הקרינה היה זממו כפונקציה של המרחק לחתוך את והתאים ידי הפונקציה המעריכית מוצג מס &#39;3.8 לעיל (איור 2 ד ו איור. 4D). שטח ערכים קבועים עבור כל תנאימוצגים נתוני 2E וגם 4E, הממחישות כי היקף צימוד צומת הפער נותב ניתן לכמת באמצעות טכניקה לחתוך הטעינה. בנוסף, התוצאות הן מאוד לשחזור. השתמש בטכניקה לחתוך טעינת כאמצעי לכימות מידת צימוד צומת הפער נותב הוא תוקף גם על ידי הממצא כי עוצמת הקרינה פוחתת אקספוננציאלית כפונקציה של מרחק החתך בכל המקרים שנבדקו 7,8 (ראה גם תאנים. 2D ו 4D כאן), המציין כי neurobiotin נכנס photoreceptors דרך לחתוך את הסכין ולא מאתרים אחרים ברשתית. יתר על כן, דומה איכותית יום / לילה הבדל צימוד נותב photoreceptor תא שנצפתה דג זהב עם זריקות נותב לתוך הקונוסים יחיד עם טעינת לחתוך 7 ממחיש לחתוך טעינת כאמצעי מדויק יחסית למדוד את מידת צימוד photoreceptor. לחתוך-lטכניקה oading יכול לשמש גם כדי לחקור סוגים אחרים של סינפסות חשמל ברשתית. לדוגמה, איור 5 מדגים כי ארנבת מסוג (איור 5 א) ו-B-type (איור 5 ב) תאים אופקיים התערוכה הומולוגיים נותב צימוד הבא לגזור העמסה דיפוזיה של neurobiotin תחת כהה מותאם לתנאי. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> תרכובת </td><td> דג </td><td> עכבר </td><td> ארנב </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 130 </td><td> 120 </td><td> 117 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 20 </td><td> 25 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> לאא 2 PO 4 </td><td> - </td><td> 1 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 2.5 </td><td> 5 </td><td> 3.1 </td></tr><tr><td> גלוקוז </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MgSO 4-7H 2 O </td><td> - </td><td> 1 </td><td> 1.2 </td></tr><tr><td> גלוטמין </td><td> - </td><td> 0.1 </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 0.7 </td><td> 2 </td><td> 2 </td></tr></tbody></table> טבלה 1: הרכב פתרונות של Ringer עבור עכבר דג זהב, ואת הרשתיות ארנב. ריכוזים מוצגים מ&quot;מ. הפתרונות של Ringer הם מבעבע עם 5% CO 2 / 95% O 2 ומתוחזק על 22 ° C (דגים) או 36 ° C (יונקים). &quot;-&quot;: לא כלול Ringer על מין זה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig1.jpg" /> איור 1:. תרשים זרימה המציג את ההליך לחתוך הטעינה. לאחר בידוד of הרשתית העצבית שלם, חתכים רדיאליים כמה נעשו על ידי להב כי היה טבול הראשון פתרון neurobiotin 0.5%. הרשתית הודגר לטעינת נותב ודיפוזיה, ורחץ אז לפני קיבוע עם paraformaldehyde 4% (PFA) ב 0.1M פוספט חיץ (PB). נותב צימוד נבדקה באמצעות streptavidin-Alexa מצומדות-488. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig2.jpg" /> באיור 2. יום ולילה ההבדל צימוד נותב photoreceptor ב דג זהב מתגלה על ידי טכניקה לחתוך הטעינה. הפער photoreceptor תא צומת neurobiotin צימוד נותב היה מקיף בלילה (ב) ו למחרת היישום של spiperone (10 מיקרומטר), קולטן דופמין סלקטיבית 2 D אנטגוניסט (ג), אבל לא היום בתנאים מלאה (A). ד) מנורמל עוצמת פלורסנט יחסית כפונקציה של המרחק מן הקיצוצים (מסומנת בחצים ב AC). ה) שטח קבוע valUES לקבל את הנתונים בניסויים אחרים D (n = 4). *** P &lt;0.001. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig3.jpg" /> באיור 3. דוגמה מייצגת מראה הקרינה בשכבת התאים קולטי האור ברשתית כהה מותאם דגי זהב בלילה הבא לגזור טעינה עם פתרון של שתי neurobiotin ו rhodamine dextran. Rhodamine dextran (באדום), אשר אינו מפוזר דרך צומת לפתוח ערוצי פער בשל משקל מולקולרי גבוה (&gt; 10000 MW), רק תאים שכותרתו ליד החתך. לעומת זאת, neurobiotin (מוצג ירוק) מתפזרת דרך צמתים הפער ניתן לראות בתאים photoreceptor רחוק החתך. מיקום החתך מסומנת על ידי החץ בלוח אחד. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig4.jpg" /> איור 4. יום ולילה שוניםence ב photoreceptor נותב צימוד ברשתית ארנב מתגלה על ידי טכניקה לחתוך הטעינה. הפער photoreceptor תא צומת neurobiotin צימוד נותב היה מקיף בלילה (ב) ו למחרת היישום של spiperone (10 מיקרומטר) (ג), אבל לא היום בתנאים מלאה (A). ב-AC, תצוגות בניצב השחזור 3D של photoreceptors ארנב ליד לחתוך מוצגים. ד) מנורמל עוצמת פלורסנט יחסית כפונקציה של המרחק מן הקיצוץ. E) ערכים שטח קבוע שהתקבלו הנתונים בניסויים אחרים D (n = 3). *** P &lt;0.001. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig5.jpg" /> איור 5. Cut-loading מגלה כי כהה מותאם תאים ארנב אופקי הם מצמידים נותב. שניהם סוג (A) ו-B-type (ב) בתאים אופקיים כהה מותאם הרשתיות ארנב הציג הומולוגיים צימוד neurobiotin נותב.

<ol>
	<li>Bennett, M. V. L., Zukin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+coupling+and+neuronal+synchronization+in+the+mammalian+brain.">Electrical coupling and neuronal synchronization in the mammalian brain.</a> Neuron. 41, 495-511 (2004).</li><li>Connors, B. W., Long, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+synapses+in+the+mammalian+brain.">Electrical synapses in the mammalian brain.</a> Annu. Rev. Neurosci. 27, 393-418 (2004).</li><li>Vaney, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Many+diverse+types+of+retinal+neurons+show+tracer+coupling+when+injected+with+biocytin+or+Neurobiotin.">Many diverse types of retinal neurons show tracer coupling when injected with biocytin or Neurobiotin.</a> Neurosci. Lett. 125, 187-190 (1991).</li><li>Bloomfield, S. A., V&#246;lgyi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+functional+roles+and+regulation+of+neuronal+gap+junctions+in+the+retina.">The diverse functional roles and regulation of neuronal gap junctions in the retina.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 495-506 (2009).</li><li>Weiler, R., Pottek, M., He, S., Vaney, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+coupling+between+retinal+horizontal+cells+by+retinoic+acid+and+endogenous+dopamine.">Modulation of coupling between retinal horizontal cells by retinoic acid and endogenous dopamine.</a> Brain. Res. Brain. Res. Rev. 32, 121-129 (2000).</li><li>Xin, D., Bloomfield, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+nitric+oxide+on+horizontal+cells+in+the+rabbit+retina.">Effects of nitric oxide on horizontal cells in the rabbit retina.</a> Vis. Neurosci. 17, 799-811 (2000).</li><li>Ribelayga, C., Cao, Y., Mangel, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+circadian+clock+in+the+retina+controls+rod-cone+coupling.">The circadian clock in the retina controls rod-cone coupling.</a> Neuron. 59, 790-801 (2008).</li><li>Ribelayga, C., Mangel, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+circadian+clock-controlled+neural+pathway+in+the+rabbit+retina.">Identification of a circadian clock-controlled neural pathway in the rabbit retina.</a> PLoS One. 5, e11020-e11020 (2010).</li><li>Ouyang, X., Winbow, V. M., Patel, L. S., Burr, G. S., Mitchell, C. K., O'Brien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Kinase+A+mediates+regulation+of+gap+junctions+containing+connexin35+through+a+complex+pathway.">Protein Kinase A mediates regulation of gap junctions containing connexin35 through a complex pathway.</a> Brain. Res. Mol. Brain. Res. 135, 1-11 (2005).</li><li>Patel, L. S., Mitchell, C. K., Dubinsky, W. P., O'Brien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+gap+junction+coupling+through+the+neuronal+connexin+Cx35+by+nitric+oxide+and+cGMP.">Regulation of gap junction coupling through the neuronal connexin Cx35 by nitric oxide and cGMP.</a> Cell. Commun. Adhes. 13, 41-54 (2006).</li><li>Peters, J. L., Cassone, V. M., Zoran, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+modulates+intercellular+communication+among+cultured+chick+astrocytes.">Melatonin modulates intercellular communication among cultured chick astrocytes.</a> Brain. Res. 1031, 10-19 (2005).</li><li>Cusato, K., Bosco, A., Rozental, R., Guimar&#227;es, C. A., Reese, B. E., Linden, R., Spray, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+mediate+bystander+cell+death+in+developing+retina.">Gap junctions mediate bystander cell death in developing retina.</a> J. Neurosci. 23, 6413-6422 (2003).</li><li>Li, H., Chuang, A. Z., O'Brien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+coupling+is+controlled+by+connexin+35+phosphorylation+in+zebrafish+retina.">Photoreceptor coupling is controlled by connexin 35 phosphorylation in zebrafish retina.</a> J. Neurosci. 29, 15178-15186 (2009).</li><li>Mills, S. L., Massey, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetics+of+tracer+movement+through+homologous+gap+junctions+in+the+rabbit+retina.">The kinetics of tracer movement through homologous gap junctions in the rabbit retina.</a> Vis. Neurosci. 15, 765-777 (1998).</li><li>Mills, S. L., Massey, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+biotinylated+tracers+distinguishes+three+types+of+gap+junction+in+retina.">A series of biotinylated tracers distinguishes three types of gap junction in retina.</a> J. Neurosci. 20, 8629-8636 (2000).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השיטה לגזור טעינת המתוארת כאן היא טכניקה יעילה וישירה על מנת לקבוע את מידת צימוד צומת נותב הפער בין הנוירונים ברשתית בתנאי תאורה שונים בזמנים שונים של היום והלילה. היתרונות של שיטה זו כוללים את היכולת לכמת את מידת צימוד צומת הפער נותב בין הנוירונים ברקמת הרשתית שלם תחת מגוון רחב של תנאי תאורה במהלך היום והלילה ולעשות זאת עבור נוירונים יחד, כי יש somata בקוטר קטן. מגבלות השיטה בחקר צמתים הפער בסתיו רקמות שלמות לשתי קטגוריות כלליות. ראשית, דיפוזיה נותב דרך צמתים הפער פתוח עלול להיות קשה יחסית להבחין בשל קוטר) קטן או תשלום הקשורים הערוצים פתוחים ב) כרכים היחסי של תאים סלולריים בשילוב 1,14,15. כלומר, דיפוזיה נותב מתא לתא קטן גדול או קבוצת תאים יחד, compared דיפוזיה נותב מתא לתא גדול יותר, עשוי להיות קשה יותר לזהות עקב דילול נותב. שנית, תחת כמה תנאים פיזיולוגיים, היקף דיפוזיה נותב דרך צמתים הפער רקמות שלמות לא יכול לשקף במדויק את עוצמת מוליכות הפער junctional בשל ההבדלים המוליכות של קטן הנוכחי נושאת יונים חשמליים, לעומת חדירות של נותב גדול יחסית מולקולות 1,14,15. ככלל, עדות נותב צימוד מראים נוכחות, תפקוד ערוצי פער פתוח בצומת, אך תחת כמה תנאים פיזיולוגיים, דיפוזיה נותב לא יכול להתרחש או לצפות למרות הקלטות אלקטרו מצביעים על נוכחות של, מתפקד צמתים לפתוח פער. סביר להניח כי הטכניקה לחתוך טעינת יכול לשמש גם כדי לחקור את מידת צימוד צומת הפער נותב בין הנוירונים ברקמות שלמות מאזורים אחרים של sys העצבים המרכזיתTEM.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> Tricaine sulfonate מתאן (MS222) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5040 </td><td> 150 מ&quot;ג / ליטר של מים שנאגרו אקווריום </td></tr><tr><td> Urethane </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> U2500 </td><td> 2 גר &#39;/ מנה kgloading </td></tr><tr><td> Tube Dual Night Vision goggle </td><td> לילה אופטיקה ארה&quot;ב </td><td> D-221 </td><td></td></tr><tr><td> נייר סינון, מס &#39;4 כיתה </td><td> Whatman </td><td> 1004-090 </td><td></td></tr><tr><td> מלקחיים בסדר, דומון מס &#39;5, Biologie, 11 ס&quot;מ </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 11295-10 </td></tr><tr><td> מספריים בסדר, קפיץ, 8 מ&quot;מ להב, ישר </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 15025-10 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Neurobiotin </td><td> וקטור </td><td> SP-1120 </td><td> 0.5% </td></tr><tr><td> Streptavidin-מצומדות אלכסה 488 </td><td> Invitrogen </td><td> S11223 </td><td> 2% </td></tr><tr><td> Dextran rhodamine (גבוה (&gt; 10000) MW) </td><td> Invitrogen </td><td> D1817 </td><td> 0.5% </td></tr><tr><td> Vectashield בינוני הרכבה </td><td> וקטור </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Zeiss 510 META לייזר סריקת מיקרוסקופ Confocal </td><td> Carl Zeiss, Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LSM-5 תמונה דפדפן 3,2,0,115 </td><td> Carl Zeiss, Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ImageJ תוכנה </td><td> NIH </td><td></td><td></td></tr><tr><td> OriginPro 8.0 </td><td> OriginLab קורפ </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cut-loading: a useful tool for examining the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons

בנוסף לשידור כימיים הסינפטי, נוירונים המחוברים על ידי צמתים הפער יכול גם לתקשר במהירות באמצעות העברה סינפטית חשמל. הגדלת הראיות עולה כי הפער לא רק בצמתים היתר זרימת זרם חשמלי ופעילות סינכרונית בין תאים או בשילוב ביניהם, אך כי כוח או היעילות של תקשורת בין תאים חשמליים בשילוב יכול להיות מווסתת על 1,2 במידה רבה. בנוסף, קוטר פנימי גדול (~ 1.2 ננומטר) של ערוצים רבים צומת הפער היתרי לא רק לזרום זרם חשמלי, אלא גם דיפוזיה של מולקולות איתות תאיים ומטבוליטים קטן בין תאים מחוברים, כך צמתים הפער עשוי גם לתווך תקשורת מטבוליים וכימיים . עוצמתה של התקשורת junctional הפער בין נוירונים אפנון על ידי נוירוטרנסמיטורים וגורמים אחרים ניתן ללמוד בו זמנית על ידי חשמלית הקלטה מתאי יחד ועל ידי קביעת tהוא מידת דיפוזיה של מולקולות נותב, שהן צומת הפער חדיר, אבל לא קרום חדיר, בעקבות הזרקת iontophoretic לתוך תאים בודדים. עם זאת, נהלים אלה יכול להיות קשה מאוד לביצוע על נוירונים עם somata קטן רקמה עצבית ללא פגע. מחקרים רבים על הסינפסות חשמל אפנון התקשורת חשמל נערכו ברשתית חוליות, שכן כל אחד מחמשת סוגי נוירונים ברשתית מחובר חשמלית על ידי הפער צמתים 3,4. ראיות הגדלת הראו כי שעון היממה (24 שעות) ברשתית ושינויים גירוי האור להסדיר צומת הפער מצמד 3-8. לדוגמה, העבודה האחרונה הוכיחה כי שעון היממה רשתית פוחתת צומת הפער צימוד בין מוט ותאי קונוס photoreceptor במהלך היום על ידי הפעלת קולטן דופמין הגדלת D2 ו מגדילה באופן דרמטי את מוט חרוט צימוד בלילה על ידי צמצום הפעלת הקולטן D2 <sup&gt; 7,8. עם זאת, לא רק את המחקרים הללו קשה מאוד לבצע על נוירונים עם somata קטן ברקמת הרשתית העצבית שלם, אבל זה יכול להיות קשה לשלוט באופן הולם את תנאי התאורה במהלך המחקר אלקטרו של נוירונים ברשתית יחיד להימנע אור-Induced שינויים צומת הפער המוליכות. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה לקבוע את מידת צימוד צומת נותב הפער בין הנוירונים ברשתית בתנאי תאורה שונים, בזמנים שונים של היום והלילה. זו טכניקה לחתוך טוען הוא שינוי של טעינת לגרד 9-12, אשר מבוססת על טעינת דיפוזיה לצבוע בערוצים צומת לפתוח פער. טעינת לגרד עובד היטב בתאים בתרבית, אך לא פרוסות עבות כגון הרשתית ללא פגע. הטכניקה לחתוך טעינה נעשה שימוש כדי ללמוד צימוד photoreceptor בדגים שלמים הרשתיות יונקים 7, 8,13, וניתן להשתמש בו כדי ללמוד צימוד ביןנוירונים אחרים ברשתית, כפי שתואר כאן.

Watch this Scientific Journal Video about Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons at JoVE.com

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

השיטה קלה ונוחה, כדי לקבוע את מידת צימוד צומת הפער נותב בין הנוירונים ברשתית מתואר. טכניקה זו מאפשרת לחקור את הפונקציה של סינפסות חשמליות בין הנוירונים ברשתית שלמים בתנאי תאורה שונים, בזמנים שונים של היום והלילה.

Cut-טעינה: כלי שימושי לבחינת היקף Coupling צומת גאפ נותב בין הנוירונים רשתית

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

תרבות Organotypic בהיפוקמפוס Slice דגם לבחינת פגיעה עצבית

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

הצמד תיקון הקלטות מתא עצב עכבר רשתית בהכנת Dark המותאמות פרוסה

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Dissection העין עכבר על הר שלם של האפיתל פיגמנט רשתית

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

מתא בודד פרופיל של נוירונים רשתית מתפתחות מבוגרים

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Antibody Transfection into Neurons as a Tool to Study Disease Pathogenesis

Transfection נוגדן לנוירונים ככלי ללימוד פתוגנזה מחלות

Antibodies provide the ability to gain novel insight into various events taking place in living systems.  The ability to produce highly specific ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

תמונה רציפה-הלבנה להתוות תאי שווא יחידים בצומת Neuromuscular

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

מיקרו-Iontophoresis מהיר של גלוטמט וגאבא: כלי שימושי לחקירת האינטגרציה סינפטית

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Assay היבלעות: פרוטוקול להעריך אינטראקציות בין מערכת העצבים המרכזית וPhagocytes נוירונים

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...