Name: cut-loading: a useful tool for examining the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons
Uploaded: 2012-01-12T12:00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons at JoVE.com

इस काम NIH अनुदान EY005102 द्वारा सीपीआर करने के लिए SCM और EY018640 वित्त पोषित किया गया

<ol>
	<li>Bennett, M. V. L., Zukin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+coupling+and+neuronal+synchronization+in+the+mammalian+brain.">Electrical coupling and neuronal synchronization in the mammalian brain.</a> Neuron. 41, 495-511 (2004).</li><li>Connors, B. W., Long, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+synapses+in+the+mammalian+brain.">Electrical synapses in the mammalian brain.</a> Annu. Rev. Neurosci. 27, 393-418 (2004).</li><li>Vaney, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Many+diverse+types+of+retinal+neurons+show+tracer+coupling+when+injected+with+biocytin+or+Neurobiotin.">Many diverse types of retinal neurons show tracer coupling when injected with biocytin or Neurobiotin.</a> Neurosci. Lett. 125, 187-190 (1991).</li><li>Bloomfield, S. A., V&#246;lgyi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+functional+roles+and+regulation+of+neuronal+gap+junctions+in+the+retina.">The diverse functional roles and regulation of neuronal gap junctions in the retina.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 495-506 (2009).</li><li>Weiler, R., Pottek, M., He, S., Vaney, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+coupling+between+retinal+horizontal+cells+by+retinoic+acid+and+endogenous+dopamine.">Modulation of coupling between retinal horizontal cells by retinoic acid and endogenous dopamine.</a> Brain. Res. Brain. Res. Rev. 32, 121-129 (2000).</li><li>Xin, D., Bloomfield, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+nitric+oxide+on+horizontal+cells+in+the+rabbit+retina.">Effects of nitric oxide on horizontal cells in the rabbit retina.</a> Vis. Neurosci. 17, 799-811 (2000).</li><li>Ribelayga, C., Cao, Y., Mangel, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+circadian+clock+in+the+retina+controls+rod-cone+coupling.">The circadian clock in the retina controls rod-cone coupling.</a> Neuron. 59, 790-801 (2008).</li><li>Ribelayga, C., Mangel, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+circadian+clock-controlled+neural+pathway+in+the+rabbit+retina.">Identification of a circadian clock-controlled neural pathway in the rabbit retina.</a> PLoS One. 5, e11020-e11020 (2010).</li><li>Ouyang, X., Winbow, V. M., Patel, L. S., Burr, G. S., Mitchell, C. K., O'Brien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Kinase+A+mediates+regulation+of+gap+junctions+containing+connexin35+through+a+complex+pathway.">Protein Kinase A mediates regulation of gap junctions containing connexin35 through a complex pathway.</a> Brain. Res. Mol. Brain. Res. 135, 1-11 (2005).</li><li>Patel, L. S., Mitchell, C. K., Dubinsky, W. P., O'Brien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+gap+junction+coupling+through+the+neuronal+connexin+Cx35+by+nitric+oxide+and+cGMP.">Regulation of gap junction coupling through the neuronal connexin Cx35 by nitric oxide and cGMP.</a> Cell. Commun. Adhes. 13, 41-54 (2006).</li><li>Peters, J. L., Cassone, V. M., Zoran, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+modulates+intercellular+communication+among+cultured+chick+astrocytes.">Melatonin modulates intercellular communication among cultured chick astrocytes.</a> Brain. Res. 1031, 10-19 (2005).</li><li>Cusato, K., Bosco, A., Rozental, R., Guimar&#227;es, C. A., Reese, B. E., Linden, R., Spray, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+mediate+bystander+cell+death+in+developing+retina.">Gap junctions mediate bystander cell death in developing retina.</a> J. Neurosci. 23, 6413-6422 (2003).</li><li>Li, H., Chuang, A. Z., O'Brien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+coupling+is+controlled+by+connexin+35+phosphorylation+in+zebrafish+retina.">Photoreceptor coupling is controlled by connexin 35 phosphorylation in zebrafish retina.</a> J. Neurosci. 29, 15178-15186 (2009).</li><li>Mills, S. L., Massey, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetics+of+tracer+movement+through+homologous+gap+junctions+in+the+rabbit+retina.">The kinetics of tracer movement through homologous gap junctions in the rabbit retina.</a> Vis. Neurosci. 15, 765-777 (1998).</li><li>Mills, S. L., Massey, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+biotinylated+tracers+distinguishes+three+types+of+gap+junction+in+retina.">A series of biotinylated tracers distinguishes three types of gap junction in retina.</a> J. Neurosci. 20, 8629-8636 (2000).</li></ol>

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

कटौती लोड हो रहा है यहाँ वर्णित विधि अलग रोशनी की शर्तों के तहत और दिन और रात के अलग अलग समय पर रेटिना न्यूरॉन्स के बीच की खाई जंक्शन ट्रेसर युग्मन की सीमा निर्धारित करने के लिए एक उपयोगी और सरल तकनीक है. इस तकनीक का लाभ रोशनी शर्तों की एक किस्म के तहत दिन और रात के दौरान बरकरार रेटिना ऊतक में न्यूरॉन्स के बीच अंतराल जंक्शन ट्रेसर युग्मन की हद तक और यों मिलकर न्यूरॉन्स है कि छोटे व्यास somata के लिए ऐसा करना करने की क्षमता शामिल हैं. दो सामान्य श्रेणियों में बरकरार ऊतक गिरावट में अंतर जंक्शनों के अध्ययन में तकनीक की सीमाएं. पहला, खुला अंतराल जंक्शनों के माध्यम से ट्रेसर प्रसार अपेक्षाकृत मुश्किल हो) के छोटे व्यास या खुला चैनल और ख) युग्मित सेलुलर डिब्बों के रिश्तेदार मात्रा 1,14,15 के साथ जुड़े प्रभारी के कारण निरीक्षण कर सकते हैं. यही कारण है, एक छोटे सेल से एक बड़ा कक्ष या मिलकर कोशिकाओं के समूह, COMP करने के लिए प्रसार ट्रेसरट्रेसर एक बड़ा कक्ष से एक छोटे सेल प्रसार ared, और अधिक मुश्किल हो ट्रेसर कमजोर पड़ने के कारण का पता लगाने सकता है. दूसरा, कुछ शारीरिक शर्तों के तहत, ट्रेसर प्रसार के माध्यम से बरकरार ऊतक में अंतर जंक्शनों की हद तक सही अंतराल junctional प्रवाहकत्त्व की ताकत छोटे से बिजली के वर्तमान ले जाने के आयनों के प्रवाहकत्त्व में मतभेद के कारण अपेक्षाकृत बड़े दरियाफ्त की पारगम्यता की तुलना में प्रतिबिंबित नहीं हो सकता है 1,14,15 अणुओं. सामान्य में, ट्रेसर युग्मन के सबूत जोरदार कामकाज, खुला अंतराल जंक्शन चैनलों की मौजूदगी से पता चलता है, लेकिन कुछ शारीरिक शर्तों के तहत, ट्रेसर प्रसार हो या नहीं हो मनाया भले ही electrophysiological रिकॉर्डिंग कामकाज, खुला अंतराल जंक्शनों की उपस्थिति का सुझाव कर सकते हैं. यह संभावना लगता है कि कटौती लोड हो रहा है कि तकनीक भी बरकरार ऊतकों में केंद्रीय तंत्रिका व्यवस्था के अन्य क्षेत्रों से न्यूरॉन्स के बीच अंतराल जंक्शन ट्रेसर युग्मन की हद तक की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैमंदिर.

<table border="1"><tbody><tr><td> अभिकर्मक के नाम </td><td> कंपनी </td><td> सूचीपत्र संख्या </td><td> टिप्पणियां (वैकल्पिक) </td></tr><tr><td> Tricaine मीथेन sulfonate (MS222) </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> A5040 </td><td> 150 मिलीग्राम / बफर मछली टैंक पानी के एल </td></tr><tr><td> Urethane </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> U2500 </td><td> 2 / छ kgloading खुराक </td></tr><tr><td> दोहरी ट्यूब नाइट विजन चश्मा </td><td> रात प्रकाशिकी संयुक्त राज्य अमेरिका </td><td> डी 221 </td><td></td></tr><tr><td> फिल्टर पेपर, ग्रेड सं 4 </td><td> वाटमान </td><td> 1004-090 </td><td></td></tr><tr><td> ठीक संदंश, Dumont 5 नहीं, Biologie, 11 सेमी लंबी </td><td> ललित विज्ञान उपकरण </td><td> 11295-10 </td></tr><tr><td> ठीक कैंची, वसंत भरी हुई, 8 मिमी ब्लेड सीधे, </td><td> ललित विज्ञान उपकरण </td><td> 15025-10 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Neurobiotin </td><td> वेक्टर </td><td> SP-1120 </td><td> 0.5% </td></tr><tr><td> Streptavidin संयुग्मित 488 एलेक्सा </td><td> Invitrogen </td><td> S11223 </td><td> 2% </td></tr><tr><td> Dextran rhodamine (उच्च (10,000) मेगावाट) </td><td> Invitrogen </td><td> D1817 </td><td> 0.5% </td></tr><tr><td> Vectashield बढ़ते मध्यम </td><td> वेक्टर </td><td> एच 1000 </td><td></td></tr><tr><td> Zeiss 510 मेटा स्कैनिंग लेजर confocal सूक्ष्मदर्शी </td><td> कार्ल Zeiss, Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LSM-5 छवि ब्राउज़र 3,2,0,115 </td><td> कार्ल Zeiss, Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ImageJ सॉफ्टवेयर </td><td> एनआईएच </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 8.0 OriginPro </td><td> OriginLab कॉर्प </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cut-loading: a useful tool for examining the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic transmission. Increasing evidence indicates that gap junctions not only permit electrical current flow and synchronous activity between interconnected or coupled cells, but that the strength or effectiveness of electrical communication between coupled cells can be modulated to a great extent1,2. In addition, the large internal diameter (~1.2 nm) of many gap junction channels permits not only electric current flow, but also the diffusion of intracellular signaling molecules and small metabolites between interconnected cells, so that gap junctions may also mediate metabolic and chemical communication. The strength of gap junctional communication between neurons and its modulation by neurotransmitters and other factors can be studied by simultaneously electrically recording from coupled cells and by determining the extent of diffusion of tracer molecules, which are gap junction permeable, but not membrane permeable, following iontophoretic injection into single cells. However, these procedures can be extremely difficult to perform on neurons with small somata in intact neural tissue.
Numerous studies on electrical synapses and the modulation of electrical communication have been conducted in the vertebrate retina, since each of the five retinal neuron types is electrically connected by gap junctions3,4. Increasing evidence has shown that the circadian (24-hour) clock in the retina and changes in light stimulation regulate gap junction coupling3-8. For example, recent work has demonstrated that the retinal circadian clock decreases gap junction coupling between rod and cone photoreceptor cells during the day by increasing dopamine D2 receptor activation, and dramatically increases rod-cone coupling at night by reducing D2 receptor activation7,8. However, not only are these studies extremely difficult to perform on neurons with small somata in intact neural retinal tissue, but it can be difficult to adequately control the illumination conditions during the electrophysiological study of single retinal neurons to avoid light-induced changes in gap junction conductance.
Here, we present a straightforward method of determining the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons under different illumination conditions and at different times of the day and night. This cut-loading technique is a modification of scrape loading9-12, which is based on dye loading and diffusion through open gap junction channels. Scrape loading works well in cultured cells, but not in thick slices such as intact retinas. The cut-loading technique has been used to study photoreceptor coupling in intact fish and mammalian retinas7, 8,13, and can be used to study coupling between other retinal neurons, as described here.

Watch this Scientific Journal Video about Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons at JoVE.com

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

रेटिना न्यूरॉन्स के बीच अंतराल जंक्शन ट्रेसर युग्मन की सीमा निर्धारित करने के लिए एक आसान और सुविधाजनक विधि वर्णित है. इस तकनीक को एक अलग रोशनी की शर्तों के तहत और दिन और रात के अलग अलग समय पर बरकरार रेटिना में न्यूरॉन्स के बीच बिजली के synapses के समारोह की जांच करने के लिए सक्षम बनाता है.

कट लोड हो रहा है: रेटिना न्यूरॉन्स के बीच गैप जंक्शन अनुरेखक युग्मन की सीमा की जांच के लिए एक उपयोगी टूल

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Neuronal चोट की जांच करने के लिए Organotypic hippocampal स्लाइस संस्कृति मॉडल

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

पैच एक डार्क अनुकूलित स्लाइस तैयारी में माउस रेटिना न्यूरॉन्स से दबाना रिकॉर्डिंग

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

एक माउस आँखों के रेटिना वर्णक उपकला के एक पूरे पर्वत के लिए विच्छेदन

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

विकासशील और परिपक्व रेटिना न्यूरॉन्स की रूपरेखा एकल कक्ष

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Antibody Transfection into Neurons as a Tool to Study Disease Pathogenesis

रोग रोगजनन का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण के रूप में न्यूरॉन्स में एंटीबॉडी अभिकर्मक

Antibodies provide the ability to gain novel insight into various events taking place in living systems.  The ability to produce highly specific ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

अनुक्रमिक neuromuscular जंक्शन पर एकल श्वान कोशिकाओं को चित्रित फोटो विरंजन

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

ग्लूटामेट और गाबा की फास्ट माइक्रो योणोगिनेसिस: Synaptic एकता की जांच के लिए एक उपयोगी उपकरण

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

एक घिराव परख: सीएनएस फ़ैगोसाइट और न्यूरॉन्स के बीच बातचीत का आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

एक neuronal प्रोटीन न्यूरॉन्स में एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग अप्राकृतिक एमिनो एसिड का उपयोग की ऑप्टिकल नियंत्रण

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए माउस रेटिना लयाओ-अनुभागों की तैयारी

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...