Name: cut-loading: a useful tool for examining the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons
Uploaded: 2012-01-12T12:00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons at JoVE.com

Эта работа финансировалась NIH грант EY005102 к СКМ и EY018640 в КНР

<ol>
	<li>Bennett, M. V. L., Zukin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+coupling+and+neuronal+synchronization+in+the+mammalian+brain.">Electrical coupling and neuronal synchronization in the mammalian brain.</a> Neuron. 41, 495-511 (2004).</li><li>Connors, B. W., Long, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+synapses+in+the+mammalian+brain.">Electrical synapses in the mammalian brain.</a> Annu. Rev. Neurosci. 27, 393-418 (2004).</li><li>Vaney, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Many+diverse+types+of+retinal+neurons+show+tracer+coupling+when+injected+with+biocytin+or+Neurobiotin.">Many diverse types of retinal neurons show tracer coupling when injected with biocytin or Neurobiotin.</a> Neurosci. Lett. 125, 187-190 (1991).</li><li>Bloomfield, S. A., V&#246;lgyi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+functional+roles+and+regulation+of+neuronal+gap+junctions+in+the+retina.">The diverse functional roles and regulation of neuronal gap junctions in the retina.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 495-506 (2009).</li><li>Weiler, R., Pottek, M., He, S., Vaney, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+coupling+between+retinal+horizontal+cells+by+retinoic+acid+and+endogenous+dopamine.">Modulation of coupling between retinal horizontal cells by retinoic acid and endogenous dopamine.</a> Brain. Res. Brain. Res. Rev. 32, 121-129 (2000).</li><li>Xin, D., Bloomfield, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+nitric+oxide+on+horizontal+cells+in+the+rabbit+retina.">Effects of nitric oxide on horizontal cells in the rabbit retina.</a> Vis. Neurosci. 17, 799-811 (2000).</li><li>Ribelayga, C., Cao, Y., Mangel, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+circadian+clock+in+the+retina+controls+rod-cone+coupling.">The circadian clock in the retina controls rod-cone coupling.</a> Neuron. 59, 790-801 (2008).</li><li>Ribelayga, C., Mangel, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+circadian+clock-controlled+neural+pathway+in+the+rabbit+retina.">Identification of a circadian clock-controlled neural pathway in the rabbit retina.</a> PLoS One. 5, e11020-e11020 (2010).</li><li>Ouyang, X., Winbow, V. M., Patel, L. S., Burr, G. S., Mitchell, C. K., O'Brien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Kinase+A+mediates+regulation+of+gap+junctions+containing+connexin35+through+a+complex+pathway.">Protein Kinase A mediates regulation of gap junctions containing connexin35 through a complex pathway.</a> Brain. Res. Mol. Brain. Res. 135, 1-11 (2005).</li><li>Patel, L. S., Mitchell, C. K., Dubinsky, W. P., O'Brien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+gap+junction+coupling+through+the+neuronal+connexin+Cx35+by+nitric+oxide+and+cGMP.">Regulation of gap junction coupling through the neuronal connexin Cx35 by nitric oxide and cGMP.</a> Cell. Commun. Adhes. 13, 41-54 (2006).</li><li>Peters, J. L., Cassone, V. M., Zoran, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+modulates+intercellular+communication+among+cultured+chick+astrocytes.">Melatonin modulates intercellular communication among cultured chick astrocytes.</a> Brain. Res. 1031, 10-19 (2005).</li><li>Cusato, K., Bosco, A., Rozental, R., Guimar&#227;es, C. A., Reese, B. E., Linden, R., Spray, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+mediate+bystander+cell+death+in+developing+retina.">Gap junctions mediate bystander cell death in developing retina.</a> J. Neurosci. 23, 6413-6422 (2003).</li><li>Li, H., Chuang, A. Z., O'Brien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+coupling+is+controlled+by+connexin+35+phosphorylation+in+zebrafish+retina.">Photoreceptor coupling is controlled by connexin 35 phosphorylation in zebrafish retina.</a> J. Neurosci. 29, 15178-15186 (2009).</li><li>Mills, S. L., Massey, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetics+of+tracer+movement+through+homologous+gap+junctions+in+the+rabbit+retina.">The kinetics of tracer movement through homologous gap junctions in the rabbit retina.</a> Vis. Neurosci. 15, 765-777 (1998).</li><li>Mills, S. L., Massey, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+biotinylated+tracers+distinguishes+three+types+of+gap+junction+in+retina.">A series of biotinylated tracers distinguishes three types of gap junction in retina.</a> J. Neurosci. 20, 8629-8636 (2000).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Сократить загрузкой метод, описанный здесь, полезные и просто технику, чтобы определить степень разрыва соединения трассирующими связи между нейронами сетчатки при различных условиях освещенности и в разное время дня и ночи. Преимущества этого метода включают в себя возможность количественно степень разрыва связи трассирующими соединения между нейронами в интактной ткани сетчатки при различных условиях освещенности в течение дня и ночью, и делать это для связанных нейронов, которые имеют небольшие somata диаметре. Ограничения техники в изучении щелевые контакты в интактной ткани падения на две основные категории. Во-первых, трассирующими диффузии через открытые переходы зазор может быть довольно трудно заметить из-за) малого диаметра или заряда, связанные с открытым каналам и б) относительные объемы связанных сотовой отсеков 1,14,15. То есть, трассирующими диффузии из маленькой камере с большим ячейку или группу связанных клетки, компared к трассирующими диффузии из больших ячейки меньше клетки, может быть более трудно обнаружить из-за разведения индикатора. Во-вторых, при некоторых физиологических состояниях, степень трассирующими диффузии через щелевые контакты в неповрежденной ткани могут не точно отражать силу разрыва соединительных проводимости из-за разницы в проводимости небольшого электрического тока ионы, по сравнению с проницаемостью относительно больших трассирующими молекул 1,14,15. В общем, доказательства трассирующими связи наводит на мысль, присутствие функционирования, открытых каналов соединения разрыв, но при некоторых физиологических состояниях, трассирующими диффузии может не произойти, или наблюдать, хотя электрофизиологические записи свидетельствуют о наличии функционирования, открытые переходы пробел. Вполне вероятно, что сокращение загрузки метод также может быть использован для исследования степени разрыва связи трассирующими соединения между нейронами в неповрежденной ткани из других регионов центральной нервной системытемпература.

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td><td> Комментарии (необязательно) </td></tr><tr><td> Tricaine метан сульфонат (MS222) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5040 </td><td> 150 мг / л буферной воде аквариума </td></tr><tr><td> Уретан </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> U2500 </td><td> 2 г / kgloading дозы </td></tr><tr><td> Двойная труба ночного видения Goggle </td><td> Ночь оптика США </td><td> D-221 </td><td></td></tr><tr><td> Фильтровальной бумаги, класс № 4 </td><td> Ватман </td><td> 1004-090 </td><td></td></tr><tr><td> Изобразительное щипцы, Дюмон № 5, Biologie, 11 см в длину </td><td> Инструменты изобразительных наук </td><td> 11295-10 </td></tr><tr><td> Изобразительное Ножницы, подпружиненный, 8 мм лезвия, прямые </td><td> Инструменты изобразительных наук </td><td> 15025-10 </td><td></td></tг&gt; <tr><td> Neurobiotin </td><td> Вектор </td><td> SP-1120 </td><td> 0,5% </td></tr><tr><td> Стрептавидин-сопряженных Alexa 488 </td><td> Invitrogen </td><td> S11223 </td><td> 2% </td></tr><tr><td> Декстран родамина (высокая (&gt; 10 000) МВт) </td><td> Invitrogen </td><td> D1817 </td><td> 0,5% </td></tr><tr><td> Vectashield монтажа среда </td><td> Вектор </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Zeiss 510 META лазерного сканирования конфокальной микроскопии </td><td> Carl Zeiss, Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LSM-5 Image Browser 3,2,0,115 </td><td> Carl Zeiss, Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ImageJ Software </td><td> NIH </td><td></td><td></td></tr><tr><td> OriginPro 8,0 </td><td> Корпорация OriginLab </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cut-loading: a useful tool for examining the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic transmission. Increasing evidence indicates that gap junctions not only permit electrical current flow and synchronous activity between interconnected or coupled cells, but that the strength or effectiveness of electrical communication between coupled cells can be modulated to a great extent1,2. In addition, the large internal diameter (~1.2 nm) of many gap junction channels permits not only electric current flow, but also the diffusion of intracellular signaling molecules and small metabolites between interconnected cells, so that gap junctions may also mediate metabolic and chemical communication. The strength of gap junctional communication between neurons and its modulation by neurotransmitters and other factors can be studied by simultaneously electrically recording from coupled cells and by determining the extent of diffusion of tracer molecules, which are gap junction permeable, but not membrane permeable, following iontophoretic injection into single cells. However, these procedures can be extremely difficult to perform on neurons with small somata in intact neural tissue.
Numerous studies on electrical synapses and the modulation of electrical communication have been conducted in the vertebrate retina, since each of the five retinal neuron types is electrically connected by gap junctions3,4. Increasing evidence has shown that the circadian (24-hour) clock in the retina and changes in light stimulation regulate gap junction coupling3-8. For example, recent work has demonstrated that the retinal circadian clock decreases gap junction coupling between rod and cone photoreceptor cells during the day by increasing dopamine D2 receptor activation, and dramatically increases rod-cone coupling at night by reducing D2 receptor activation7,8. However, not only are these studies extremely difficult to perform on neurons with small somata in intact neural retinal tissue, but it can be difficult to adequately control the illumination conditions during the electrophysiological study of single retinal neurons to avoid light-induced changes in gap junction conductance.
Here, we present a straightforward method of determining the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons under different illumination conditions and at different times of the day and night. This cut-loading technique is a modification of scrape loading9-12, which is based on dye loading and diffusion through open gap junction channels. Scrape loading works well in cultured cells, but not in thick slices such as intact retinas. The cut-loading technique has been used to study photoreceptor coupling in intact fish and mammalian retinas7, 8,13, and can be used to study coupling between other retinal neurons, as described here.

Watch this Scientific Journal Video about Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons at JoVE.com

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

Легкий и удобный метод для определения степени разрыва связи трассирующими стыке нейронов сетчатки описано. Этот метод позволяет исследовать функцию электрических синапсов между нейронами в нетронутой сетчатки при различных условиях освещенности и в разное время дня и ночи.

Cut-загрузки: полезный инструмент для изучения Протяженность Gap Муфта Tracer стыке нейронов сетчатки

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Органотипической гиппокампа Модель культуры фрагмент за рассмотрение нейронов травмы

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Патч зажим Recordings от мыши нейронов сетчатки в темно-адаптированной фрагмент подготовка

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Препарирование Мышь Око за полного горе пигментный эпителий сетчатки

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Одноклеточный профилирования развивающихся и зрелых нейронов сетчатки

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Antibody Transfection into Neurons as a Tool to Study Disease Pathogenesis

Антитела Трансфекция в нейроны, как инструмент для изучения патогенеза заболевания

Antibodies provide the ability to gain novel insight into various events taking place in living systems.  The ability to produce highly specific ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Последовательное фото-отбеливание разграничить отдельные клетки шванновских в нервно-мышечном соединении

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Быстрый Micro-ионтофорезом глутамата и ГАМК: полезный инструмент по расследованию Synaptic интеграции

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Охвате Анализ: Протокол для оценки взаимодействия между ЦНС фагоцитов и нейронов

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Оптический контроль нейронального белка с использованием генетически кодируемой искусственную аминокислоту в нейронах

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Подготовка крио-секций мышиной подвздошной сыки для иммуногистохимии

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...