1. Isolation des PBMC <ol><li> Prélever le sang (7,5 à 8,0 ml) dans un tube BD Vacutainer CPT Préparation des cellules avec de l&#39;héparine de sodium. Le tube contient un anticoagulant héparine sodique et d&#39;un fluide de densité Ficoll-Hypaque, plus une barrière de gel de polyester, qui sépare les deux liquides. Centrifuger le tube / échantillon de sang à température ambiante (18 ° C à 25 ° C) dans un rotor horizontal (swing-out tête) pendant 20 min à 1800 x g. Commutateur centrifugeuse f...

<ol>
	<li>Bonneville, M., O'Brien, R. L., Born, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#947;+T+cell+effector+functions:+a+blend+of+innate+programming+and+acquired+plasticity.">&#947; T cell effector functions: a blend of innate programming and acquired plasticity.</a> Nat Rev Immunol. 10, 467-478 (2010).</li><li>Hintz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+(E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl+pyrophosphate+as+a+major+activator+for+human+&#947;&#948;+T+cells+in+Escherichia+coli.">Identification of (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate as a major activator for human &#947;&#948; T cells in Escherichia coli.</a> FEBS Lett. 509, 317-322 (2001).</li><li>Gober, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+T+cell+receptor+&#947;&#948;+cells+recognize+endogenous+mevalonate+metabolites+in+tumor+cells.">Human T cell receptor &#947;&#948; cells recognize endogenous mevalonate metabolites in tumor cells.</a> J Exp Med. 197, 163-168 (2003).</li><li>Kabelitz, D., Wesch, D., He, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+of+gammadelta+T+cells+in+tumor+immunology.">Perspectives of gammadelta T cells in tumor immunology.</a> Cancer Res. 67, 5-8 (2007).</li><li>Roelofs, A. 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La méthode présentée ici permet l&#39;expansion efficace des cellules T γδ partir des PBMC. γδ cellules T activées et élargies par le zolédronate et IL-2 développent complète des fonctions effectrices, reflétée par la production de cytokines et la cytotoxicité. Il a été rapporté que le pyrophosphate bromhydrine synthétiques phosphoantigènes (BrHPP) et le 2-méthyl-3-butényle-1-pyrophosphate (2M3B1PP) élargira également les cellules T γδ, mais ils ne sont pas disponibles dans le commerce. En reva...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> ZOMETA </td><td> Novartis Pharma K. K </td><td></td><td> zolédronate </td></tr><tr><td> PROLEUKIN </td><td> Novartis Pharmaceuticals </td><td></td><td> IL-2 humaine recombinante </td></tr><tr><td> BD Vacutainer CPT Tube Préparation des cellules avec de l&#39;héparine de sodium </td><td> BD </td><td> 362753 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 21870-076 </td><td></td></tr><tr><td> ALyS203 moyennes </td><td> Cellule Science &amp; Technology Institute </td><td> 0301-7 </td><td></td></tr><tr><td> OpTmizer </td><td> Invitrogen </td><td> 0080022SA </td><td></td></tr><tr><td> Un bréfeldine </td><td> Sigma </td><td> B5936-200UL </td><td></td></tr><tr><td> phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) </td><td> Sigma </td><td> P1585-1MG </td><td></td></tr><tr><td> ionomycine </td><td> Sigma </td><td> 13909-1ML </td><td></td></tr><tr><td> IntraPrep </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07803 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humain CD3-FITC ou PE/Cy5 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07746 FITC A07749 PE/Cy5 </td><td></td></tr><tr><td> anti-CD4 humain DPE </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> 6604727 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humain CD8-PE/Cy5 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> 6607011 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humain CD14-PE/Cy5 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07765 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humain CD19-PE </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07769 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humain CD45-ECD </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07784 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humain CD56-PE/Cy5 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07789 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humain TCRap-PE </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A39499 </td><td></td></tr><tr><td> TCR anti-humaine-FITC Vy9 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> IM1463 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humain CD27-PE/Cy5 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> 6607107 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humain CD45RA-DPE </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> IM2711 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humain CD69-PE </td><td> BD </td><td> 555531 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humain NKG2D-PE </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A08934 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-humal IFN-PE </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> IM2717U </td><td></td></tr><tr><td> Souris IgG1 isotype contrôle-PE </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07796 </td><td></td></tr><tr><td> Souris IgG1 isotype contrôle-ECD ou PE/Cy5 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07797 A07798 </td><td></td></tr></tbody></table>

expansion of human peripheral blood  &gamma;&delta; t cells using zoledronate

L&#39;homme des cellules T γδ peuvent reconnaître et répondre à une grande variété de stress induit par les antigènes, développant ainsi une large activité innée anti-tumorale et anti-infectieux. 1 La majorité des cellules T γδ dans le sang périphérique ont le récepteur des cellules T Vγ9Vδ2. Ces cellules reconnaissent un antigène dans un complexe d&#39;histocompatibilité majeure manière indépendante et de développer de solides cytolytique et Th1-like fonctions effectrices. 1 Par conséquent, γδ lymphocytes T sont des cellules effectrices candidat intéressant pour l&#39;immunothérapie du cancer. Vγ9Vδ2 cellules T de répondre à phosphoantigènes tel que (E)-4-hydroxy-3-méthyl-but-2-ényle pyrophosphate (HMBPP), ce qui est synthétisée dans la bactérie via la biosynthèse des isoprénoïdes; 2 et isopentényl pyrophosphate (IPP), qui est produite dans les cellules eucaryotes par la voie du mévalonate. 3 Dans l&#39;état physiologique, la génération des IPP dans la cellule non transformée n&#39;est pas suffisant pour l&#39;activation des cellules T γδ. Le dérèglement de voie du mévalonate dans les cellules tumorales conduit à l&#39;accumulation des IPP et γδ lymphocytes T d&#39;activation. 3 Parce aminobisphosphonates (comme le pamidronate ou zolédronate) inhibent farnésyl pyrophosphate synthase (FPPS), l&#39;enzyme agissant en aval de la PIP dans la voie du mévalonate, les taux intracellulaires de IPP et sensitibity aux cellules T γδ reconnaissance peut être thérapeutique augmenté de aminobisphosphonates. IPP accumulation est moins efficace dans les cellules nontransfomred que des cellules tumorales avec une concentration pharmacologiquement pertinentes de aminobisphosphonates, qui nous permettent d&#39;immunothérapie pour le cancer en activant les cellules T γδ avec aminobisphosphonates 4. Fait intéressant, IPP s&#39;accumule dans les monocytes lors PBMC sont traitées avec aminobisphosphonates, en raison de l&#39;efficacité l&#39;absorption des médicaments par ces cellules. 5 monocytes qui s&#39;accumulent IPP deviennent cellules présentatrices d&#39;antigène et stimuler Vγ9Vδ2 cellules T dans le sang périphérique. 6 Basé sur ces mécanismes, nous avons développé une technique à grande échelle l&#39;expansion des cultures de cellules T γδ utilisant zolédronate et l&#39;interleukine -2 (IL-2). 7 D&#39;autres méthodes pour l&#39;expansion des cellules T γδ utiliser le pyrophosphate bromhydrine synthétiques phosphoantigènes (BrHPP) 8 ou 2-méthyl-3-butényle-1-pyrophosphate (2M3B1PP) 9. Toutes ces méthodes permettent ex l&#39;expansion in vivo, ce qui entraîne un grand nombre de cellules T γδ pour une utilisation en immunothérapie adoptive. Toutefois, seul le zolédronate est un réactif approuvé par la FDA disponible commercialement. Zolédronate-élargi γδ lymphocytes T CD27 écran - CD45RA - phénotype mémoire effecteurs et leur fonction peut être évaluée par l&#39;IFN-γ test de production 7.

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Expansion of Human Peripheral Blood  ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells using Zoledronate

Une méthode pour développer des cellules T γδ à partir des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) est décrite. PBMC dérivés des lymphocytes T γδ sont stimulés et étendu en utilisant le zolédronate et l&#39;interleukine-2 (IL-2). L&#39;expansion à grande échelle de cellules T γδ peuvent être appliquées à l&#39;immunothérapie cellulaire autologue de cancer.

Expansion du sang périphérique humain cellules T γδ utilisant zolédronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

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