Name: isolation of cd133+ liver stem cells for clonal expansion
Uploaded: 2011-10-10T13:00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion at JoVE.com

Dr Rountree erkent de huidige steun van de Children&#39;s Miracle Network, National Institute of Health, K08DK080928 en R03DK088013, en de American Cancer Society Research Scholar Award, MGO-11651. Dr Rountree erkent dat deze procedure in eerste instantie werd ontwikkeld en verfijnd, terwijl gefinancierd door de Pediatric Scientist Development Program (NICHD Grant Award K12-HD00850).

<ol>
	<li>Rountree, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CD133-expressing+murine+liver+oval+cell+population+with+bilineage+potential.">A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential.</a> Stem Cells. 25, 2419-2429 (2007).</li><li>Ding, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133++liver+cancer+stem+cells+from+methionine+adenosyl+transferase+1A-deficient+mice+demonstrate+resistance+to+transforming+growth+factor+(TGF)-beta-induced+apoptosis.">CD133+ liver cancer stem cells from methionine adenosyl transferase 1A-deficient mice demonstrate resistance to transforming growth factor (TGF)-beta-induced apoptosis.</a> Hepatology. 49, 1277-1286 (2009).</li><li>Rountree, C. B., Ding, W., He, L., Stiles, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+CD133-expressing+liver+cancer+stem+cells+in+liver-specific+phosphatase+and+tensin+homolog+deleted+on+chromosome+10-deleted+mice.">Expansion of CD133-expressing liver cancer stem cells in liver-specific phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10-deleted mice.</a> Stem Cells. 27, 290-299 (2009).</li><li>Rountree, C. B., Senadheera, S., Mato, J. M., Crooks, G. M., Lu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+liver+cancer+stem+cells+during+aging+in+methionine+adenosyltransferase+1A-deficient+mice.">Expansion of liver cancer stem cells during aging in methionine adenosyltransferase 1A-deficient mice.</a> Hepatology. 47, 1288-1297 (2008).</li><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration.">Liver regeneration.</a> J. Cell. Physiol. 213, 286-300 (2007).</li><li>Fausto, N., Campbell, J. S., Riehle, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration.">Liver regeneration.</a> Hepatology. 43, 45-53 (2006).</li><li>Theise, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+Stem+Cells.+III.+Emergent+themes+of+liver+stem+cell+biology:+niche,+quiescence,+self-renewal,+and+plasticity.">Gastrointestinal Stem Cells. III. Emergent themes of liver stem cell biology: niche, quiescence, self-renewal, and plasticity.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 290, 189-193 (2006).</li><li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+liver+repopulating+capacity+of+murine+oval+cells.">The origin and liver repopulating capacity of murine oval cells.</a> Proc Natl Acad Sci U. S. A. 100, 11881-11888 (2003).</li><li>Greenbaum, L. E., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+stem+cells+in+liver+repair+and+fibrosis.">The role of stem cells in liver repair and fibrosis.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 222-229 (2011).</li><li>Choi, S. S., Omenetti, A., Syn, W. K., Diehl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Hedgehog+signaling+in+fibrogenic+liver+repair.">The role of Hedgehog signaling in fibrogenic liver repair.</a> Int. J. Biochem. Cell. Biol. 43, 238-244 (2011).</li><li>Khurana, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scopolamine+treatment+and+muscarinic+receptor+subtype-3+gene+ablation+augment+azoxymethane-induced+murine+liver+injury.">Scopolamine treatment and muscarinic receptor subtype-3 gene ablation augment azoxymethane-induced murine liver injury.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 333, 639-649 (2010).</li><li>Sell, S., Leffert, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+cancer+stem+cells.">Liver cancer stem cells.</a> J. Clin. Oncol. 26, 2800-2805 (2008).</li><li>Lee, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+prognostic+subtype+of+human+hepatocellular+carcinoma+derived+from+hepatic+progenitor+cells.">A novel prognostic subtype of human hepatocellular carcinoma derived from hepatic progenitor cells.</a> Nat. Med. 12, 410-416 (2006).</li><li>Sell, S., Dunsford, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+stem+cell+origin+of+hepatocellular+carcinoma+and+cholangiocarcinoma.">Evidence for the stem cell origin of hepatocellular carcinoma and cholangiocarcinoma.</a> Am. J. Pathol. 134, 1347-1363 (1989).</li><li>Amin, R., Mishra, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+stem+cells+and+tgf-Beta+in+hepatic+carcinogenesis.">Liver stem cells and tgf-Beta in hepatic carcinogenesis.</a> Gastrointest Cancer Res. 2, 27-30 (2008).</li><li>Tang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitor/stem+cells+give+rise+to+liver+cancer+due+to+aberrant+TGF-beta+and+IL-6+signaling.">Progenitor/stem cells give rise to liver cancer due to aberrant TGF-beta and IL-6 signaling.</a> Proc Natl Acad Sci. 105, 2445-2450 (2008).</li><li>Kitisin, K., Pishvaian, M. J., Johnson, L. B., Mishra, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+stem+cells+and+molecular+signaling+pathways+in+hepatocellular+carcinoma.">Liver stem cells and molecular signaling pathways in hepatocellular carcinoma.</a> Gastrointest Cancer Res. 1, 13-21 (2007).</li><li>Rountree, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+fails+to+differentiate+into+liver+epithelium+during+murine+development+and+regeneration.">Bone marrow fails to differentiate into liver epithelium during murine development and regeneration.</a> Hepatology. 45, 1250-1260 (2007).</li><li>Shimano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+oval+cells+have+the+side+population+phenotype+defined+by+expression+of+ATP-binding+cassette+transporter+ABCG2/BCRP1.">Hepatic oval cells have the side population phenotype defined by expression of ATP-binding cassette transporter ABCG2/BCRP1.</a> Am J Pathol. 163, 3-9 (2003).</li><li>Suzuki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+isolation+and+clonal+identification+of+self-renewing+bipotent+hepatic+progenitor+cells+in+adult+mouse+liver.">Flow cytometric isolation and clonal identification of self-renewing bipotent hepatic progenitor cells in adult mouse liver.</a> Hepatology. , (2008).</li><li>Suzuki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+identification+and+characterization+of+self-renewing+pluripotent+stem+cells+in+the+developing+liver.">Clonal identification and characterization of self-renewing pluripotent stem cells in the developing liver.</a> J Cell Biol. 156, 173-184 (2002).</li><li>Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EpCAM-positive+hepatocellular+carcinoma+cells+are+tumor-initiating+cells+with+stem/progenitor+cell+features.">EpCAM-positive hepatocellular carcinoma cells are tumor-initiating cells with stem/progenitor cell features.</a> Gastroenterology. 136, 1012-1024 (2009).</li><li>Yamashita, T., Budhu, A., Forgues, M., Wang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+hepatic+stem+cell+marker+EpCAM+by+Wnt-beta-catenin+signaling+in+hepatocellular+carcinoma.">Activation of hepatic stem cell marker EpCAM by Wnt-beta-catenin signaling in hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Res. 67, 10831-10839 (2007).</li><li>Furuyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cell+supply+from+a+Sox9-expressing+progenitor+zone+in+adult+liver,+exocrine+pancreas+and+intestine.">Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine.</a> Nat Genet. 43, 34-41 (2011).</li><li>Kordes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133++hepatic+stellate+cells+are+progenitor+cells.">CD133+ hepatic stellate cells are progenitor cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 352, 410-417 (2007).</li><li>Berg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+Growth+Factor+10+is+critical+for+liver+growth+during+embryogenesis+and+controls+of+hepatoblast+survival+via+b-catenin+activation.">Fibroblast Growth Factor 10 is critical for liver growth during embryogenesis and controls of hepatoblast survival via b-catenin activation.</a> Hepatology. , (2007).</li><li>Turner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatic+stem+cell+and+maturational+liver+lineage+biology.">Human hepatic stem cell and maturational liver lineage biology.</a> Hepatology. 53, 1035-1045 (2011).</li><li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+restriction+of+human+hepatic+stem+cells+to+mature+fates+is+made+efficient+by+tissue-specific+biomatrix+scaffolds.">Lineage restriction of human hepatic stem cells to mature fates is made efficient by tissue-specific biomatrix scaffolds.</a> Hepatology. 53, 293-305 (2011).</li><li>Galicia, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+hepatic+tumor+progenitor+cells+in+Pten-null+mice+requires+liver+injury+and+is+reversed+by+loss+of+AKT2.">Expansion of hepatic tumor progenitor cells in Pten-null mice requires liver injury and is reversed by loss of AKT2.</a> Gastroenterology. 139, 2170-2182 (2010).</li><li>Ding, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-to-mesenchymal+transition+of+murine+liver+tumor+cells+promotes+invasion.">Epithelial-to-mesenchymal transition of murine liver tumor cells promotes invasion.</a> Hepatology. 52, 945-953 (2010).</li></ol>

Dr Rountree krijgt ondersteuning van het onderzoek van Bayer Farmacie. Drs. Ding en Crooks en mevrouw Dang en mevrouw VanKirk hebben geen mededelingen te melden.

In tegenstelling tot de hematopoietische systeem, waarin hematopoietische stamcellen zijn verantwoordelijk voor een systeem dat celdifferentiatie replacesnormal fysiologische omzetsnelheid van leukocyten, rode bloedcellen en bloedplaatjes leverstamceltechnologie of volwassen progenitorcellen, niet deelnemen in normale lever homeostase. 5,6 Na acute leverbeschadiging of gedeeltelijke hepatectomie, hepatocyten, zoals gedifferentieerde lever epitheel, ondergaan verschillende rondes van proliferatie om de verloren lever massa te vervangen. 5,6 Alleen tijdens chronische blessure zijn lever waargenomen stamcellen te vermenigvuldigen. 1,5 -11 Deze volwassen, orgaan-specifieke stamcellen voorgesteld te differentiëren tot zowel hepatocyten en cholangiocyten. 1,5-8 Interessant is dat de overgrote meerderheid van leverkanker ontwikkelt zich op de achtergrond van chronische schade, en dus lever stamcellen ook hypothese te de voorlopers voor een subset van leverkanker. 2-4,12-17 One van de belangrijkste uitdagingen naar cel werk voort in de lever is isolatie van zeldzame populaties van cellen voor functionele analyse. Bijvoorbeeld, de meeste cellen in de lever hepatocyten, die aanzienlijk groter zijn dan cholangiocyten en kleinere niet-parenchymale cellen. Door het breken van de gehele lever in celcompartimenten (grote hepatocyten - parenchymale fractie en kleinere cellen - niet-parenchymale fractie), en verder selecteren van CD45 negatieve cellen (niet-hematopoëtische cellen), kunnen wij de startpopulatie van stamcellen verrijken meer dan 600-voudige. 1,18-21 We merken wij geenszins aangeeft dat de CD133 + populatie is een 100% zuiver stamcelpopulatie, maar duidelijk een heterogene populatie van cellen met verschillende afkomst en herbevolking potentieel. Een van de belangrijkste beperkingen van het veld definities van stamcellen en progenitorcellen. We gebruiken de term &quot;stamcel&quot; ruimer in dit werk, maar in strikte definitie, CD133 + niet-parenchymal cellen vormen een bi-lijn stamvader bevolking. Gezien de stand van de huidige stam en progenitor onderzoek in de lever, dit rapport geeft wel een startplaats voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in dit gebied. Als nieuwe markers ontstaan ​​zoals EpCAM, 22,23 of transcriptiefactoren, zoals Sox9, 24 kunnen worden opgenomen. Zo hebben we een vrij hoge mate van overlap tussen EpCAM + CD133 + cellen en cellen. In dit rapport hebben we detail een werkwijze voor de stamcel los van de normale muizen lever en chronische leverschade modellen, die aantonen verhoogde lever stamcel proliferatie. Deze methode heeft duidelijke voordelen ten opzichte van standaard immunohistochemie bevroren of formaline gefixeerde lever functionele studies met levende cellen kan worden uitgevoerd na isolatie. 1,3,4 Het specifieke doel van deze werkwijze is het isoleren van een relatief zuivere populatie lever stamcellen die kunnen klonaal worden uitgebreid in vitro. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; De belangrijkste beperking van deze procedure is dat de meerderheid van de geïsoleerde cellen niet levensvatbaar zal zijn na flowcytometrie (zie Problemen oplossen sectie). Dit is het gevolg van de uren nodig om de cellen te bereiden en de talrijke procedures nodig zijn om de populatie te verfijnen voor isolatie. Als de lever verteerd in enkele celsuspensie voor onmiddellijke FACS analyse zal het verschil in grootte tussen hepatocyten en andere niet-parenchymale cellen te creëren effectieve FACS gate onmogelijk. Als de lever niet-parenchymale cellen worden gebruikt, zonder uitsluiting van hematopoietische cellen, bestaat het risico dat een aanzienlijk aantal CD133 + cellen kunnen van hematopoietische oorsprong kan de fractie verontreinigen. Bovendien door verwerking van de cellen door de Miltenyi filter worden alleen enkele cellen en zeer kleine clusters van cellen verzameld. Dit zorgt ervoor dat het monster niet zal verstoppen de FACS inname naald. Alternatieven voor deze procedure omvatten mIJZIGING aan alternatieve celoppervlaktemarker, zoals CD49f, EpCAM of combinatie van merkers, zoals CD133 + + EpCAM Een tweede gepubliceerd rapport gebruikt een dichtheidsgradiënt de lever stamcellen te isoleren uit een niet-parenchymale fractie. Deze procedure vereist een Ultra-centrifuge (8000 xg), voegt aanzienlijke tijd om de procedure en in onze ervaring, aanzienlijk verminderd pre-FACS cellulaire opbrengst en post-FACS levensvatbaarheid. 8 Toekomstige experimenten een breder gamma van genexpressie analyse, inclusief foetale lever genen, zoals HNF3, HNF4α en αfp.In Bovendien Western blot analyse en immunocytochemie van tot expressie gebrachte eiwitten kunnen worden gebruikt voor RT-PCR resultaten van cellen in kweek te bevestigen. Een probleem om op te merken is recent werk dat CD133 expressie geïdentificeerd op leverstellaatcellen. 25 We hebben nu routinematig onze monsters te screenen op markers van stellaatcellen (zie Problemen oplossen sectie), en hebben niet identified aanzienlijke verontreiniging in onze fracties. Dit kan verband houden met verschillende technieken van lever spijsvertering en celisolatie. 2,3,26 Gebaseerd op het feit dat de meeste cellen niet levensvatbaar onmiddellijk na isolatie FACS raden wij de cellen uitgeplaat zijn, als bulk CD133 + cellen of enkele cellen, voor gebruik bij dieren. 5-7 dagen in vitro geeft significant betere resultaten van de tumor analyse. Bovendien, gezien de ontberingen van enkele cel isolatie, moet deze alleen worden uitgevoerd zodra kolonies kan worden uitgebreid van bulk CD133 + geïsoleerde cellen. Een uitvoerige bespreking van de verschillende kweekomstandigheden en scaffold proteïnen die kunnen worden gebruikt voor cultuur lever stam-en progenitorcellen is goed gekarakteriseerd door Lola Reid. Dit werk biedt alternatieve voorwaarden en wijzigingen, die onderzoekers kunnen nemen in hun onderzoeksprogramma keer elementaire isolatietechnieken worden beheerst. 27,28 Dr Reid&#39;s work biedt ook een meer gedetailleerde analyse van het geslacht biologie en rijping tussen hepatische stamcellen en daarvoor bestemde voorlopercellen. In termen van in vivo tumor analyse hebben we succes gehad met vers geïsoleerde cellen en cellen van klonaal geëxpandeerd CD133 + cellen in vitro, voornamelijk met 1x10 6 cellen. We hebben ons gericht ontwo genetische stammen van chronische leverschade, de MAT1a - / - en de lever specifieke PTEN - / - muizen, en we hebben gebruik gemaakt van zowel naakt muizen en wild-type muizen als gastheren voor tumorgroei. In onze ervaring, zal CD133 + lever stamcellen maken alleen tumoren gebruikt als ze geïsoleerd zijn van aanzienlijke leverbeschadiging modellen die pre-maligne. Merk op dat de tumoren gevormd uit CD133 + cellen algemeen hebben zowel hepatocellulair carcinoom en cholangiocarcinoom functies, hetgeen duidt op een stamcel-of progenitor cel oorsprong naar de tumoren. 2-4,29 Follow-up werk na tumoren worden gedocumenteerd includes standaard pathologische analyse van tumorweefsel (H &amp; E kleuring) en immunohistochemische kleuring. Bovendien kunnen tumoren worden gemalen en gedigereerd voor FACS analyse of re-cultuur. 2-4,30 Tot slot hebben we gedetailleerd een procedure voor de isolatie, uitbreiding, en basiskarakterisering van CD133 + lever stamcellen en CD133 + kankerstamcellen. Trouble Shooting: CD45 verontreiniging: In stap 3 als er verontreiniging van CD45 + cellen, die worden beoordeeld door toevoeging van een CD45-FITC Ab voor FACS-analyse en isolatie, controleer dat de CD45 microbead antilichaam niet is verlopen en het filtraat werd verzameld alleen tijdens de filter is in de magnetische houder. Elke filtraat verzameld als het filter niet in de magnetische houder bevat CD45 + cellen. Low aantal cellen: Voor de niet-gewonde lever, de totale number van CD133 + niet-parenchymale geïsoleerd kan minder dan 10.000. Deze cellen zijn zeldzaam in de rustige lever. Een chronisch letsel model, zoals DDC 0,1% dieet, het aantal sterk toenemen tot 100.000 cellen. Als het totale aantal cellen is aanzienlijk lager dan deze nummers, een punt van overweging is de FACS Ab kleuring. Controleer of de CD133 Ab niet is verlopen, een slechte kleuring leidt tot een slechte opbrengst. Tevens raden uitvoeren van een FACS analyse van de lever niet-parenchymale cellen van de relatieve populatie vóór bepalen poging FACS isolatie. Laag cellevensvatbaarheid na FACS: Een van de problemen van de levensvatbaarheid kan worden gerelateerd aan hoe de cellen worden verwerkt en op welk tijdstip. Idealiter zou de hele cel isolatie procedure, stappen 1-4, worden uitgevoerd zonder enige vertraging tussen de stappen en voltooid in op dezelfde dag. Elke belangrijke vertraging tussen de stappen 1-4 zal sterk verminderen van de levensvatbaarheid van de cellen. Een tweede probleem in verband met cell levensvatbaarheid kan worden gerelateerd aan de mantel druk voor FACS isolatie. Wij raden u aan een lagere schede druk. Tenslotte wanneer de cellen worden geïsoleerd, moeten ze direct geplateerd, elke aanzienlijke opslag op ijs na sortering zal ook levensvatbaarheid. CD133 + niet-parenchymale heterogeniteit: Recente rapporten blijkt dat leverstellaatcellen kan ook CD133 expressie en enige plasticiteit. 25 Daarom naast controle bi-potentie genen met albumine en Krt19 aanvullende verificatie genen geassocieerd met stellaatcellen, zoals de gliale fibrillaire zure proteïne in zijn rustende stellaatcellen en alfa-gladde spier actine en desmine in geactiveerde stellaatcellen. 3,4,26 Bovendien is de CD133 + populatie vertegenwoordigt een bredere populatie progenitor. De toevoeging van een tweede marker, zoals EpCAM kan bijdragen dat de bevolking verder te verfijnen en beperken heterogeniteit.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het reagens </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogusnummer </th><th> Opmerkingen (optioneel) </th></tr><tr><td> DMEM: F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565-018 </td><td> Met fenolrood </td></tr><tr><td> CD45 microkorrels </td><td> Miltenyi </td><td> 130-052-301 </td><td></td></tr><tr><td> Hepatocyt groeifactor </td><td> Sigma </td><td> H1404 </td><td></td></tr><tr><td> Epidermal Growth Factor </td><td> Sigma </td><td> E4127 </td><td></td></tr><tr><td> DNase </td><td> Sigma </td><td> DN25 </td><td> 1 gram </td></tr><tr><td> Collagenase D </td><td> Roche </td><td> 1088874 </td><td></td></tr><tr><td> Pronase </td><td> Roche </td><td> 0165921 </td><td></td></tr><tr><td> 70 micron zeef </td><td> Visser </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Omniscript RT </td><td> Quaigen </td><td> 205111 </td><td> 50 reacties </td></tr><tr><td> HotStarTaq </td><td> Quaigen </td><td> 203203 </td><td></td></tr><tr><td> Miltenyi LD kolom </td><td> Miltenyi </td><td> 130-042-901 </td><td></td></tr><tr><td> CD133-PE FACS Ab </td><td> eBioscience </td><td> 12-1331-82 </td><td></td></tr><tr><td> Laminine beklede platen </td><td> BD </td><td> 354410 </td><td> 96 goed </td></tr><tr><td> 0,05% trypsine EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-354 </td><td> 100 mL </td></tr><tr><td> RNeasy Micro Kit </td><td> Quaigen </td><td> 74004 </td><td> 50 kolommen voor 5x10 5 cellen of minder </td></tr><tr><td> Pharm Lyse </td><td> BD </td><td> 555899 </td><td> 10X concentratie </td></tr></tbody></table>

isolation of cd133+ liver stem cells for clonal expansion

Leverstamceltechnologie of ovale cellen prolifereren bij chronische leverschade en voorgesteld te differentiëren tot zowel hepatocyten en cholangiocyten. Bovendien, lever stamcellen hypothese als de voorlopers voor een subset van leverkanker, hepatocellulair carcinoom. Een van de belangrijkste uitdagingen cel werken stam in elke vaste orgaan zoals de lever is het isoleren van een populatie van zeldzame cellen voor gedetailleerde analyse. Bijvoorbeeld, de meeste cellen in de lever hepatocyten (parenchymale fractie), die aanzienlijk groter zijn dan niet-parenchymale cellen. Door verrijking van het specifieke cellulaire compartimenten van de lever (ie parenchym en niet-parenchymale fracties) en het selecteren op CD45 negatieve cellen, kunnen we beginnen de populatie van stamcellen verrijken met meer dan 600 fold.The proceduresdetailed in dit rapport mogelijk een relatief zeldzame populatie van cellen van een orgaantransplantatie efficiënt worden gesorteerd. Dit proces kan worden gebruikt om isolateliver stamcellen van normale muizen lever en chronische leverbeschadiging modellen die verhoogde lever stamcelproliferatie tonen. Deze methode heeft duidelijke voordelen ten opzichte van standaard immunohistochemie bevroren of formaline gefixeerde lever functionele studies met levende cellen kan worden uitgevoerd na de eerste co-lokalisatie experimenten. Om de procedure die in dit rapport te bereiken wordt een werkrelatie met een op onderzoek gebaseerde flow-cytometrie kern sterk aangemoedigd als de details van FACS isolatie zijn sterk afhankelijk van gespecialiseerde instrumentatie en een sterke praktische kennis van elementaire flow-cytometrie procedures. Het specifieke doel van deze werkwijze is het isoleren van een populatie van lever stamcellen die klonaal kan worden uitgebreid in vitro.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion at JoVE.com

Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion

Hier beschrijven we de isolatie van CD133 tot expressie lever stamcellen en kanker stamcellen van muizen gehele lever, een proces dat weefsel spijsvertering, cel verrijkingscocktail en flowcytometrie isolatie vereist. Wij omvatten methoden voor geavanceerde single cell isolatie en klonale expansie.

Isolatie van CD133 + lever stamcellen voor klonale expansie

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Isolatie en transplantatie van hematopoietische stamcellen (HSC)

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

Isolatie en grootschalige expansie van volwassen humane endotheelcellen kolonievormende Progenitor Cellen

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

Isolatie en dierlijk serum vrije expansie van de mens navelstreng Afgeleid Mesenchymale stromale cellen (MSC&#39;s) en Endotheliale Colony Forming progenitor cellen (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

Isolatie en Afleiding van muis embryonale cellen Germinal

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Isolatie van stamcellen uit menselijke pancreaskanker xenotransplantaten

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Isolatie van Mouse speekselklier Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolatie en Cultuur van individuele myovezels en hun satelliet cellen van volwassen skeletspier

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Naïve Volwassen stamcellen Isolatie van primaire humane fibroblastkweken

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Inductie en analyse van epitheliale naar mesenchymale transitie

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

Isolatie van humane hepatocyten door een twee-stap Collagenase Perfusie Procedure

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...