Name: isolation of cd133+ liver stem cells for clonal expansion
Uploaded: 2011-10-10T13:00:00
Duration: 12 min 6 s
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Dr Rountree reconnaît le soutien actuel du Réseau Enfants-Santé, Institut National de la Santé, et de K08DK080928 R03DK088013, et la Société américaine du cancer Research Scholar Award, MGO-11651. Dr Rountree reconnaît que cette procédure a été initialement développé et affiné tout financé par le Programme de développement scientifique en pédiatrie (NICHD Grant Award K12-HD00850).

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	<li>Rountree, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CD133-expressing+murine+liver+oval+cell+population+with+bilineage+potential.">A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential.</a> Stem Cells. 25, 2419-2429 (2007).</li><li>Ding, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133++liver+cancer+stem+cells+from+methionine+adenosyl+transferase+1A-deficient+mice+demonstrate+resistance+to+transforming+growth+factor+(TGF)-beta-induced+apoptosis.">CD133+ liver cancer stem cells from methionine adenosyl transferase 1A-deficient mice demonstrate resistance to transforming growth factor (TGF)-beta-induced apoptosis.</a> Hepatology. 49, 1277-1286 (2009).</li><li>Rountree, C. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+hepatic+tumor+progenitor+cells+in+Pten-null+mice+requires+liver+injury+and+is+reversed+by+loss+of+AKT2.">Expansion of hepatic tumor progenitor cells in Pten-null mice requires liver injury and is reversed by loss of AKT2.</a> Gastroenterology. 139, 2170-2182 (2010).</li><li>Ding, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-to-mesenchymal+transition+of+murine+liver+tumor+cells+promotes+invasion.">Epithelial-to-mesenchymal transition of murine liver tumor cells promotes invasion.</a> Hepatology. 52, 945-953 (2010).</li></ol>

Dr Rountree reçoit un soutien de recherche de Pharmacie de Bayer. Drs. Ding et Crooks et Mme Dang et Mme VanKirk n&#39;ont aucune divulgation à signaler.

Contrairement au système hématopoïétique, dans lequel les cellules souches hématopoïétiques sont responsables de maintenir un système de différenciation cellulaire qui replacesnormal physiologiques turn-over des leucocytes, des globules rouges et de plaquettes, de cellules souches du foie, ou un adulte les cellules progénitrices du foie, ne participent pas au foie normal homéostasie 5,6. Après une lésion hépatique aiguë ou une hépatectomie partielle, les hépatocytes, l&#39;épithélium du foie différenciées, subissent plusieurs cycles de multiplication pour remplacer la masse du foie a perdu 5,6. Seulement pendant des blessures chroniques sont des cellules souches du foie observées à proliférer. 1,5 -11 Ces adultes, les cellules souches d&#39;organes spécifiques sont proposées pour se différencier en hépatocytes et deux cholangiocytes. 1,5-8 intéressant, la grande majorité des cancers du foie se développe sur fond de blessures chroniques, et donc les cellules souches du foie sont également émis l&#39;hypothèse d&#39;être les précurseurs d&#39;un sous-ensemble de cancer du foie. 2-4,12-17 Un des défis majeurs pour enrayer le travail des cellules dans le foie est l&#39;isolement des populations de cellules rares pour l&#39;analyse fonctionnelle. Par exemple, la grande majorité des cellules dans le foie sont les hépatocytes, qui sont nettement plus grandes que cholangiocytes et autres petits cellules non parenchymateuses. En brisant le foie entier dans des compartiments cellulaires (hépatocytes grands - fraction du parenchyme et des cellules plus petites - non parenchymateuses fraction), et encore la sélection des cellules CD45 négatives (non-cellules hématopoïétiques), nous sommes capables d&#39;enrichir la population de départ de cellules souches par plus de 600 fois. 1,18-21 Fait à noter, nous sommes en aucun cas ce qui indique que la population CD133 + est un 100% de la population de cellules souches pures, mais représente clairement une population hétérogène de cellules, avec la lignée différente et le potentiel de repopulation. Une des principales limites de ce champ est la définition des cellules souches et cellules progénitrices. Nous utilisons les &quot;cellules souches&quot; terme plus largement dans ce travail, mais dans une définition stricte, CD133 + non parenchymateuses cellules représentent une population progénitrices bi-lignée. Étant donné l&#39;état de cellules souches progénitrices et des recherches actuelles dans le foie, ce rapport fournit un point de départ pour les enquêteurs qui sont intéressés dans ce domaine. Comme de nouveaux marqueurs émergent, tels que EpCAM, 22,23 ou des facteurs de transcription, tels que Sox9, 24 ils peuvent être incorporés. Par exemple, nous avons trouvé un taux assez élevé de chevauchement entre les cellules EpCAM + et CD133 + cellules. Dans ce rapport, nous détaillons un processus d&#39;isolement de cellules souches du foie murin normale ainsi que les modèles des lésions hépatiques chroniques, qui démontrent une prolifération accrue des cellules du foie souches. Cette méthode a des avantages évidents sur immunohistochimie standard de foie congelé ou fixé au formol que des études fonctionnelles utilisant des cellules vivantes peut être effectuée après l&#39;isolement. 1,3,4 L&#39;objectif spécifique de ce processus consiste à isoler une population relativement pure de cellules souches du foie qui peut être élargi par clonage in vitro. La principale limitation de cette procédure est que la majorité des cellules isolées ne sera pas viable après la cytométrie de flux (voir la section Dépannage). Ceci est le résultat des heures requises pour préparer les cellules, et les nombreuses procédures nécessaires pour affiner la population avant l&#39;isolement. Si le foie est digéré en suspension seule cellule d&#39;analyse FACS immédiat, la différence de taille entre les hépatocytes et d&#39;autres cellules non parenchymateuses se rendre effective la création porte FACS impossible. Si le foie non parenchymateuses cellules sont utilisées, sans élimination des cellules hématopoïétiques, il ya un risque qu&#39;un nombre significatif de cellules CD133 + peut être d&#39;origine hématopoïétique peut contaminer la fraction. Par ailleurs, en traitant les cellules à travers le filtre Miltenyi, seulement des cellules individuelles et des grappes très petit nombre de cellules sont collectées. Cela garantit que l&#39;échantillon ne sera pas obstruer l&#39;aiguille d&#39;admission par FACS. Alternatives pour cette procédure incluent la modification de tout marqueur de surface cellulaire de remplacement, comme CD49f, EpCAM, ou une combinaison de marqueurs, tels que CD133 + + EpCAM Un deuxième rapport publié utilise un gradient de densité afin d&#39;isoler les cellules souches du foie d&#39;une fraction non parenchymateuses. Cette procédure nécessite une centrifugeuse ultra-(8000 xg), ajoute beaucoup de temps à la procédure, et dans notre expérience, a réduit significativement le rendement de pré-FACS cellulaires et post-FACS viabilité. 8 Les expériences futures incluent une gamme plus large de l&#39;analyse d&#39;expression génique, y compris les gènes du foie fœtal, tels que HNF3, HNF4α, et plus αfp.In, analyse Western blot et immunocytochimie des protéines exprimées peut être utilisée pour confirmer les résultats de RT-PCR de cellules en culture. Une question à noter est que les travaux récents identifié CD133 expression sur les cellules étoilées du foie. 25 Nous avons maintenant un dépistage systématique de nos échantillons pour les marqueurs des cellules étoilées (voir section Dépannage), et n&#39;ont pas d&#39;identitéentified contamination importante dans nos fractions. Ceci peut être lié à différentes techniques de la digestion du foie et de l&#39;isolement cellulaire. 2,3,26 Basé sur le fait que la majorité des cellules ne sera pas viable immédiatement après l&#39;isolement FACS, nous recommandons que les cellules soient plaqués, soit en vrac CD133 + des cellules ou des cellules isolées, avant de l&#39;utiliser chez les animaux. 5-7 jours in vitro de manière significative à améliorer les résultats de l&#39;analyse de la tumeur. En outre, étant donné les rigueurs de l&#39;isolement cellulaire unique, cela ne devrait être effectuée une fois les colonies peuvent être étendues à partir CD133 + en vrac des cellules isolées. Une discussion plus approfondie des conditions de culture différentes et des protéines d&#39;échafaudage qui peuvent être utilisées pour endiguer le foie et les cellules progénitrices de la culture a été bien caractérisé par Lola Reid. Ce travail offre des conditions alternatives et des modifications qui les enquêteurs peuvent intégrer dans leur programme de recherche une fois que les techniques d&#39;isolation de base sont maîtrisées. 27,28 Dr Travaux de Reid fournit également une analyse plus détaillée de la biologie et de la lignée de maturation entre les cellules souches et de progéniteurs hépatiques commis. En termes de l&#39;analyse des tumeurs in vivo, nous avons eu du succès en utilisant cellules fraîchement isolées et des cellules de clonage élargi CD133 + cellules in vitro, utilisant principalement 1x10 6 cellules. Nous avons concentré les souches génétiques ontwo de lésion hépatique chronique, l&#39;MAT1a - / - et PTEN spécifique du foie - / - souris, et nous avons utilisé deux souris nude et souris de type sauvage comme hôtes pour la croissance tumorale. Dans notre expérience, les cellules CD133 + tige du foie ne forment des tumeurs si elles sont isolées à partir des modèles des lésions hépatiques importantes qui sont pré-malignes. Notez que les tumeurs formées à partir des cellules CD133 + ont en général un carcinome hépatocellulaire et des fonctionnalités à la fois le cholangiocarcinome, suggérant une cellule souche ou d&#39;origine de cellules progénitrices de la tumeur. 2-4,29 Le travail de suivi après les tumeurs sont documentés comporte en standard d&#39;analyse pathologique des tissus tumoraux (coloration H &amp; E) et la coloration immunohistochimique. En outre, les tumeurs peuvent être hachée et digérées pour l&#39;analyse de FACS ou re-culture. 2-4,30 En conclusion, nous avons une procédure détaillée pour l&#39;isolement, l&#39;expansion et la caractérisation de base des cellules CD133 + souches hépatiques et CD133 + cellules souches cancéreuses. Dépannage: CD45 contamination: Pour l&#39;étape 3, s&#39;il ya contamination du CD45 des cellules +, qui peut être évaluée par l&#39;ajout d&#39;un Ab CD45-FITC avant analyse FACS et l&#39;isolement, vérifiez que l&#39;anticorps CD45 microbille n&#39;est pas expiré et que le filtrat a été recueilli seulement pendant que la filtre a été dans le support magnétique. Toute filtrat recueilli alors que le filtre n&#39;est pas dans le support magnétique contient des cellules CD45 +. Faible nombre de cellules: Pour le foie indemne, le nombre total de cellules CD133 + non parenchymateuses isolées peut être inférieur à 10 000. Ces cellules sont rares dans le foie au repos. Pour un modèle de blessures chroniques, comme le régime alimentaire CDD de 0,1%, le nombre va augmenter fortement à 100 000 cellules. Si le nombre total de cellules est nettement inférieur à ces chiffres, une question à considérer est la coloration FACS Ab. Vérifiez que le CD133 Ab n&#39;est pas expiré, que la coloration pauvres se traduira par un faible rendement. Aussi, nous vous recommandons d&#39;effectuer une analyse FACS de foie non parenchymateuses cellules pour déterminer la population relative avant l&#39;isolement FACS tentant. La viabilité des cellules après la Basse FACS: Un des problèmes de viabilité peut être liée à la façon dont les cellules sont traitées et sur quelle période. Idéalement, la procédure d&#39;isolement cellule entière, les étapes 1-4, doit être menée sans délais entre les étapes et terminé dans la même journée. Tout retard important entre les étapes 1-4 de réduire considérablement la viabilité cellulaire. Une deuxième question liée à la viabilité des cellules peut être liée à la pression gaine utilisée pour l&#39;isolation par FACS. Nous vous recommandons d&#39;utiliser une pression inférieure de la gaine. Enfin, une fois les cellules sont isolées, elles doivent être immédiatement plaquée, comme tout système de stockage important sur la glace après le tri permettra également de réduire la viabilité. CD133 + non parenchymateuses hétérogénéité: Des rapports récents indiquent que les cellules étoilées du foie peuvent aussi avoir CD133 expression et avoir une certaine plasticité. 25 Par conséquent, en plus de vérifier la puissance bi-gènes avec l&#39;albumine et de Krt19, une vérification supplémentaire peut inclure les gènes associés avec des cellules étoilées, comme fibrillaire gliale acide en protéines cellules étoilées de repos et l&#39;actine musculaire lisse alpha-et la desmine dans les cellules étoilées activées. 3,4,26 En outre, la population CD133 + représente une population plus large progénitrices. L&#39;ajout d&#39;un deuxième marqueur, comme EpCAM, peut aider à affiner davantage la population, et l&#39;hétérogénéité limite.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> DMEM: F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565-018 </td><td> Avec le rouge de phénol </td></tr><tr><td> CD45 microbilles </td><td> Miltenyi </td><td> 130-052-301 </td><td></td></tr><tr><td> Facteur de croissance des hépatocytes </td><td> Sigma </td><td> H1404 </td><td></td></tr><tr><td> Facteur de croissance épidermique </td><td> Sigma </td><td> E4127 </td><td></td></tr><tr><td> DNase </td><td> Sigma </td><td> DN25 </td><td> 1 gramme </td></tr><tr><td> Collagénase D </td><td> Roche </td><td> 1088874 </td><td></td></tr><tr><td> Pronase </td><td> Roche </td><td> 0165921 </td><td></td></tr><tr><td> 70 microns mailles </td><td> Fisher </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Omniscript RT </td><td> Quaigen </td><td> 205111 </td><td> 50 réactions </td></tr><tr><td> HotStarTaq </td><td> Quaigen </td><td> 203203 </td><td></td></tr><tr><td> Miltenyi LD colonne </td><td> Miltenyi </td><td> 130-042-901 </td><td></td></tr><tr><td> CD133-PE FACS Ab </td><td> eBioscience </td><td> 12-1331-82 </td><td></td></tr><tr><td> Plaques laminine revêtement </td><td> BD </td><td> 354410 </td><td> 96 puits </td></tr><tr><td> Trypsine 0,05% EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-354 </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> Kit RNeasy Micro </td><td> Quaigen </td><td> 74004 </td><td> 50 colonnes pour les 5x10 5 cellules ou moins </td></tr><tr><td> Pharm Lyse </td><td> BD </td><td> 555899 </td><td> Concentration 10X </td></tr></tbody></table>

isolation of cd133+ liver stem cells for clonal expansion

Cellules souches du foie, ou des cellules ovales, prolifèrent au cours des lésions hépatiques chroniques, et sont proposés à se différencier en hépatocytes et deux cholangiocytes. En outre, les cellules souches du foie sont suppose être les précurseurs d&#39;un sous-ensemble de cancer du foie, le carcinome hépatocellulaire. Un des défis principaux pour enrayer le travail des cellules dans tous les organes solides comme le foie est l&#39;isolement d&#39;une population rare de cellules pour une analyse détaillée. Par exemple, la grande majorité des cellules dans le foie sont les hépatocytes (fraction du parenchyme), qui sont nettement plus grandes que les cellules non parenchymateuses. En enrichissant les compartiments cellulaires spécifiques du foie (c.-parenchymateuses et non parenchymateuses fractions), et en sélectionnant les cellules pour CD45 négatives, nous sommes en mesure d&#39;enrichir la population de départ des cellules souches par plus de 600 fold.The proceduresdetailed dans ce rapport permettent de une population relativement rare de cellules d&#39;un organe solide à trier efficacement. Ce processus peut être utilisé pour les cellules souches du foie murin isolateliver normale ainsi que les modèles des lésions hépatiques chroniques, qui démontrent la prolifération accrue des cellules du foie souches. Cette méthode a des avantages évidents sur immunohistochimie standard de foie congelé ou fixé au formol que des études fonctionnelles utilisant des cellules vivantes peut être effectuée après la première co-localisation des expériences. Pour accomplir la procédure décrite dans ce rapport, une relation de travail avec une recherche basée cytométrie de flux de base est fortement encouragée que les détails de l&#39;isolement FACS sont fortement tributaires des instruments spécialisés et d&#39;une solide connaissance pratique de base cytométrie en flux des procédures. L&#39;objectif spécifique de ce processus consiste à isoler une population de cellules souches du foie qui peut être élargi par clonage in vitro.

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Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion

Nous décrivons ici l&#39;isolement des cellules souches CD133 exprimer foie et les cellules souches du cancer du foie murin ensemble, un processus qui nécessite la digestion des tissus, l&#39;enrichissement des cellules, et l&#39;isolement de cytométrie en flux. Nous incluent des méthodes pour l&#39;isolement cellulaire de pointe unique et l&#39;expansion clonale.

Isolement des cellules CD133 + Foie souches pour l&#39;expansion clonale

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In ...

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The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...