Name: isolation of cd133+ liver stem cells for clonal expansion
Uploaded: 2011-10-10T13:00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion at JoVE.com

ד&quot;ר ראונטרי מודה תמיכה הנוכחי מרשת נס הילדים, המכון הלאומי לבריאות, K08DK080928 ו R03DK088013, ואת האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן מחקר פרס המלומד, MgO-11651. ד&quot;ר ראונטרי מודה כי הליך זה פותחה בתחילה ומעודן בעוד ממומן על ידי תוכנית הפיתוח של המדען ילדים (NICHD פרס גרנט K12-HD00850).

<ol>
	<li>Rountree, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CD133-expressing+murine+liver+oval+cell+population+with+bilineage+potential.">A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential.</a> Stem Cells. 25, 2419-2429 (2007).</li><li>Ding, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133++liver+cancer+stem+cells+from+methionine+adenosyl+transferase+1A-deficient+mice+demonstrate+resistance+to+transforming+growth+factor+(TGF)-beta-induced+apoptosis.">CD133+ liver cancer stem cells from methionine adenosyl transferase 1A-deficient mice demonstrate resistance to transforming growth factor (TGF)-beta-induced apoptosis.</a> Hepatology. 49, 1277-1286 (2009).</li><li>Rountree, C. B., Ding, W., He, L., Stiles, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+CD133-expressing+liver+cancer+stem+cells+in+liver-specific+phosphatase+and+tensin+homolog+deleted+on+chromosome+10-deleted+mice.">Expansion of CD133-expressing liver cancer stem cells in liver-specific phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10-deleted mice.</a> Stem Cells. 27, 290-299 (2009).</li><li>Rountree, C. B., Senadheera, S., Mato, J. M., Crooks, G. M., Lu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+liver+cancer+stem+cells+during+aging+in+methionine+adenosyltransferase+1A-deficient+mice.">Expansion of liver cancer stem cells during aging in methionine adenosyltransferase 1A-deficient mice.</a> Hepatology. 47, 1288-1297 (2008).</li><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration.">Liver regeneration.</a> J. Cell. Physiol. 213, 286-300 (2007).</li><li>Fausto, N., Campbell, J. S., Riehle, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration.">Liver regeneration.</a> Hepatology. 43, 45-53 (2006).</li><li>Theise, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+Stem+Cells.+III.+Emergent+themes+of+liver+stem+cell+biology:+niche,+quiescence,+self-renewal,+and+plasticity.">Gastrointestinal Stem Cells. III. Emergent themes of liver stem cell biology: niche, quiescence, self-renewal, and plasticity.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 290, 189-193 (2006).</li><li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+liver+repopulating+capacity+of+murine+oval+cells.">The origin and liver repopulating capacity of murine oval cells.</a> Proc Natl Acad Sci U. S. A. 100, 11881-11888 (2003).</li><li>Greenbaum, L. E., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+stem+cells+in+liver+repair+and+fibrosis.">The role of stem cells in liver repair and fibrosis.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 222-229 (2011).</li><li>Choi, S. S., Omenetti, A., Syn, W. K., Diehl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Hedgehog+signaling+in+fibrogenic+liver+repair.">The role of Hedgehog signaling in fibrogenic liver repair.</a> Int. J. Biochem. Cell. Biol. 43, 238-244 (2011).</li><li>Khurana, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scopolamine+treatment+and+muscarinic+receptor+subtype-3+gene+ablation+augment+azoxymethane-induced+murine+liver+injury.">Scopolamine treatment and muscarinic receptor subtype-3 gene ablation augment azoxymethane-induced murine liver injury.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 333, 639-649 (2010).</li><li>Sell, S., Leffert, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+cancer+stem+cells.">Liver cancer stem cells.</a> J. Clin. Oncol. 26, 2800-2805 (2008).</li><li>Lee, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+prognostic+subtype+of+human+hepatocellular+carcinoma+derived+from+hepatic+progenitor+cells.">A novel prognostic subtype of human hepatocellular carcinoma derived from hepatic progenitor cells.</a> Nat. Med. 12, 410-416 (2006).</li><li>Sell, S., Dunsford, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+stem+cell+origin+of+hepatocellular+carcinoma+and+cholangiocarcinoma.">Evidence for the stem cell origin of hepatocellular carcinoma and cholangiocarcinoma.</a> Am. J. Pathol. 134, 1347-1363 (1989).</li><li>Amin, R., Mishra, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+stem+cells+and+tgf-Beta+in+hepatic+carcinogenesis.">Liver stem cells and tgf-Beta in hepatic carcinogenesis.</a> Gastrointest Cancer Res. 2, 27-30 (2008).</li><li>Tang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitor/stem+cells+give+rise+to+liver+cancer+due+to+aberrant+TGF-beta+and+IL-6+signaling.">Progenitor/stem cells give rise to liver cancer due to aberrant TGF-beta and IL-6 signaling.</a> Proc Natl Acad Sci. 105, 2445-2450 (2008).</li><li>Kitisin, K., Pishvaian, M. J., Johnson, L. B., Mishra, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+stem+cells+and+molecular+signaling+pathways+in+hepatocellular+carcinoma.">Liver stem cells and molecular signaling pathways in hepatocellular carcinoma.</a> Gastrointest Cancer Res. 1, 13-21 (2007).</li><li>Rountree, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+fails+to+differentiate+into+liver+epithelium+during+murine+development+and+regeneration.">Bone marrow fails to differentiate into liver epithelium during murine development and regeneration.</a> Hepatology. 45, 1250-1260 (2007).</li><li>Shimano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+oval+cells+have+the+side+population+phenotype+defined+by+expression+of+ATP-binding+cassette+transporter+ABCG2/BCRP1.">Hepatic oval cells have the side population phenotype defined by expression of ATP-binding cassette transporter ABCG2/BCRP1.</a> Am J Pathol. 163, 3-9 (2003).</li><li>Suzuki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+isolation+and+clonal+identification+of+self-renewing+bipotent+hepatic+progenitor+cells+in+adult+mouse+liver.">Flow cytometric isolation and clonal identification of self-renewing bipotent hepatic progenitor cells in adult mouse liver.</a> Hepatology. , (2008).</li><li>Suzuki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+identification+and+characterization+of+self-renewing+pluripotent+stem+cells+in+the+developing+liver.">Clonal identification and characterization of self-renewing pluripotent stem cells in the developing liver.</a> J Cell Biol. 156, 173-184 (2002).</li><li>Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EpCAM-positive+hepatocellular+carcinoma+cells+are+tumor-initiating+cells+with+stem/progenitor+cell+features.">EpCAM-positive hepatocellular carcinoma cells are tumor-initiating cells with stem/progenitor cell features.</a> Gastroenterology. 136, 1012-1024 (2009).</li><li>Yamashita, T., Budhu, A., Forgues, M., Wang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+hepatic+stem+cell+marker+EpCAM+by+Wnt-beta-catenin+signaling+in+hepatocellular+carcinoma.">Activation of hepatic stem cell marker EpCAM by Wnt-beta-catenin signaling in hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Res. 67, 10831-10839 (2007).</li><li>Furuyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cell+supply+from+a+Sox9-expressing+progenitor+zone+in+adult+liver,+exocrine+pancreas+and+intestine.">Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine.</a> Nat Genet. 43, 34-41 (2011).</li><li>Kordes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133++hepatic+stellate+cells+are+progenitor+cells.">CD133+ hepatic stellate cells are progenitor cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 352, 410-417 (2007).</li><li>Berg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+Growth+Factor+10+is+critical+for+liver+growth+during+embryogenesis+and+controls+of+hepatoblast+survival+via+b-catenin+activation.">Fibroblast Growth Factor 10 is critical for liver growth during embryogenesis and controls of hepatoblast survival via b-catenin activation.</a> Hepatology. , (2007).</li><li>Turner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatic+stem+cell+and+maturational+liver+lineage+biology.">Human hepatic stem cell and maturational liver lineage biology.</a> Hepatology. 53, 1035-1045 (2011).</li><li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+restriction+of+human+hepatic+stem+cells+to+mature+fates+is+made+efficient+by+tissue-specific+biomatrix+scaffolds.">Lineage restriction of human hepatic stem cells to mature fates is made efficient by tissue-specific biomatrix scaffolds.</a> Hepatology. 53, 293-305 (2011).</li><li>Galicia, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+hepatic+tumor+progenitor+cells+in+Pten-null+mice+requires+liver+injury+and+is+reversed+by+loss+of+AKT2.">Expansion of hepatic tumor progenitor cells in Pten-null mice requires liver injury and is reversed by loss of AKT2.</a> Gastroenterology. 139, 2170-2182 (2010).</li><li>Ding, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-to-mesenchymal+transition+of+murine+liver+tumor+cells+promotes+invasion.">Epithelial-to-mesenchymal transition of murine liver tumor cells promotes invasion.</a> Hepatology. 52, 945-953 (2010).</li></ol>

ד&quot;ר ראונטרי מקבל תמיכה מחקר רוקחות באייר. בני הזוג. דינג ו נוכלים גברת דאנג וגב &#39;VanKirk אין גילויים לדווח.

בניגוד למערכת hematopoietic, שבו בתאי גזע hematopoietic אחראים לשמירה מערכת בידול הסלולר replacesnormal פיזיולוגי להתהפך של לויקוציטים, בתאי דם אדומים וטסיות דם, תא גזע בכבד, או מבוגר ובתאים בכבד, אינם משתתפים כבד נורמלי הומאוסטזיס. ​​5,6 לאחר פגיעה בכבד חריפה או כריתה חלקית, hepatocytes, כמו אפיתל הכבד הבדיל, לעבור כמה סיבובים של התפשטות להחליף את מסת הכבד לאיבוד. 5,6 רק במהלך פציעה כרונית הם גזע לתאי הכבד נצפתה להתרבות. 1,5 -11, אלה המבוגרים איבר ספציפי בתאי גזע מוצעים להתמיין גם hepatocytes ו cholangiocytes. 1,5-8 מעניין, הרוב המכריע של סרטן הכבד מתפתחת על רקע של פגיעה כרונית, וכך גזע לתאי כבד הם שיערו גם להיות מבשרי עבור משנה של סרטן הכבד. 2-4,12-17 אחד האתגרים העיקריים גזע עובדים תא הכבד הוא בידוד של אוכלוסיות נדירות של תאים לניתוח פונקציונלי. למשל, הרוב המכריע של תאים בכבד הם hepatocytes, אשר גדול יותר באופן משמעותי מאשר cholangiocytes אחרים קטנים יותר שאינם parenchymal תאים. על ידי שבירת כל הכבד לתאים תאים (hepatocytes גדול - חלק parenchymal תאים קטנים יותר - שאינם parenchymal חלק), ועוד בחירה של תאים CD45 שלילי (לא hematopoietic תאים), אנו מסוגלים להעשיר את האוכלוסייה החל בתאי גזע על ידי מעל 600 של פי. 1,18-21 לציין, אנחנו בשום אופן המעידים כי האוכלוסייה CD133 + היא אוכלוסייה 100% טהור בתאי גזע, אבל ברור מייצג אוכלוסיה הטרוגנית של תאים, עם באים ממשפחות שונות ואת הפוטנציאל ואכלוס. אחת המגבלות העיקריות של התחום היא הגדרות של בתאי גזע ובתאים. אנו משתמשים &quot;תא גזע&quot; טווח רחב יותר בעבודה זו, אלא בהגדרה מחמירה, CD133 + לא parenchymal תאים מייצגים אוכלוסייה דו אבי השושלת. בהתחשב במצב הנוכחי של גזע ומחקר ובתאים בכבד, דוח זה מספק נקודת זינוק חוקרים המעוניינים בתחום זה. כמו סמנים חדשים לצוץ, כגון EpCAM, 22,23 או גורמי שעתוק, כגון Sox9, 24 הם יכולים להיות משולבים. לדוגמה, מצאנו שיעור גבוה למדי של חפיפה בין EpCAM תאים + ו-CD133 + תאים. בדו&quot;ח זה, אנו בפירוט תהליך של בידוד תא גזע מהכבד Murine נורמלית, כמו גם פגיעה כרונית מודלים הכבד, אשר גדל להפגין גזע כבד התפשטות תאים. לשיטה זו יתרונות ברורים על פני אימונוהיסטוכימיה תקן של הכבד קבוע קפוא או פורמלין כפי מחקרים תפקודית באמצעות תאים חיים יכול להתבצע לאחר בידוד. 1,3,4 המטרה הספציפיים של התהליך הזה היא לבודד אוכלוסייה טהורה יחסית של גזע לתאי כבד שיכול יורחב clonally במבחנה. המגבלה העיקרית בהליך זה היא כי הרוב המכריע של תאים בודדים לא תהיה בת קיימא לאחר cytometry זרימה (ראה סעיף קליעה Trouble). זוהי תוצאה של שעות נדרש להכין את התאים, ואת ההליכים הרבים הנדרשים כדי לחדד את האוכלוסייה לפני הבידוד. אם הכבד מתעכל ההשעיה תא בודד לניתוח FACS מיידית, את ההבדל בין גודל hepatocytes ולמוסדות אחרים ללא כוונת parenchymal תאים יגרום ליצירת FACS יעיל שער בלתי אפשרי. אם לא parenchymal בתאי הכבד מנוצלים, ללא סילוק תאים hematopoietic, קיים סיכון כי מספר משמעותי של תאים CD133 + עשוי להיות ממוצא hematopoietic עלול לזהם את השבר. יתר על כן, על ידי עיבוד התאים דרך מסנן Miltenyi, רק תאים בודדים ואשכולות קטנים מאוד של תאים נאספים. הדבר מבטיח כי המדגם לא סותמים את המחט צריכת FACS. חלופות הליך זה כולל שינוי עבור כל סמן פני חלופה התא, כגון CD49f, EpCAM, או צירוף של סמנים, כגון CD133 + + EpCAM דו&quot;ח שפורסם second מנצל שיפוע צפיפות לבודד גזע לתאי כבד מן חלק בלתי parenchymal. הליך זה מחייב צנטריפוגות Ultra-(8000 XG), מוסיף זמן משמעותי הנוהל, שעל פי ניסיוננו, הקטינה באופן משמעותי מראש FACS תשואה הסלולר ופוסט FACS הכדאיות. 8 ניסויים עתידיים כוללים מגוון רחב יותר של ניתוח ביטוי גנים, ביניהם גנים בכבד העובר, כגון HNF3, HNF4α, ועל כן αfp.In, ניתוח כתם immunocytochemistry המערבי של חלבונים הביע יכול להיות מנוצל כדי לאשר RT-PCR התוצאות של תאים בתרבית. נושא אחד לציין הוא העבודה האחרונה כי זיהו CD133 ביטוי בתאי stellate הכבד. 25 כעת אנו שגרתי מסך דגימות שלנו סמנים של תאים stellate (ראה סעיף קליעה Trouble), ויש להם לא אידentified זיהום משמעותי שברים שלנו. זו עשויה להיות קשורה בטכניקות שונות של מערכת העיכול והכבד ובידוד התא. 2,3,26 בהתבסס על העובדה כי הרוב המכריע של תאים לא תהיה בת קיימא מיד לאחר בידוד FACS, אנו ממליצים כי התאים להיות מצופה, או כפי בתפזורת CD133 + תאים או תאים בודדים, לפני השימוש בבעלי חיים. 5-7 ימים במבחנה יביא לשיפור משמעותי של התוצאות של ניתוח הגידול. בנוסף, בהתחשב בתלאות בידוד תא בודד, זה צריך להיעשות רק פעם מושבות ניתן להרחיב מ CD133 בתפזורת + תאים מבודדים. דיון מעמיק יותר מהתנאים תרבות שונים וחלבונים פיגום אשר עשוי להיות מנוצל כדי גזע ותרבות הכבד ובתאים התאפיינה גם על ידי לולה ריד. עבודה זו מספקת תנאים חלופיים שינויים, אשר החוקרים עשוי לשלב תוכנית המחקר שלהם פעם אחת הטכניקות הבסיסיות הן בידוד שולט. 27,28 ד&quot;ר יצירתו של ריד מספקת גם ניתוח מפורט יותר של הביולוגיה השושלת והתבגרות בין בתאי גזע כבד ואת אבות מחויב. במונחים של ניתוח הגידול vivo, יש לנו הצלחה באמצעות טרי תאים מבודדים תאים מורחבת clonally CD133 + תאים במבחנה, בעיקר באמצעות 1x10 6 תאים. התמקדנו זנים ontwo הגנטי של פגיעה בכבד כרוניים, MAT1a - / - ו PTEN הכבד ספציפי - / - עכברים, ויש לנו מנוצל בשני עכברים בעירום wild-type עכברים כמארחים עבור הגידול. מניסיוננו, CD133 + בתאי גזע כבד רק טופס גידולים אם הם מבודדים פגיעה משמעותית מודלים כבד כי הם טרום ממאירים. ראוי לציין, כי גידולים נוצר CD133 + תאים בכלל יש גם קרצינומה hepatocellular ותכונות בסרטן כיס המרה, דבר המצביע על תא גזע או מוצא התא ובתאים של גידולים. 2-4,29 מעקב אחרי עובדים גידולים מתועדים כולל ניתוח פתולוגי תקן של רקמת הגידול (H &amp; מכתים E) מכתים immunohistochemical. בנוסף, גידולים יכולים להיות טחון מתעכל לניתוח FACS מחדש או תרבות. 2-4,30 לסיכום, יש לנו נוהל מפורט הבידוד, הרחבת, ואפיון הבסיסיים של CD133 + בתאי גזע כבד CD133 + סרטן בתאי גזע. צרות הירי: CD45 זיהום: עבור שלב 3, אם יש זיהום CD45 + תאים, אשר ניתן להעריך על ידי הוספת CD45-FITC Ab לפני ניתוח FACS ובידוד, לבדוק על מנת להבטיח כי נוגדן CD45 microbead אינו פג וכי תסנין נאסף רק בעוד מסנן היה בעל מגנטי. תסנין כל שנאספו תוך המסנן אינו בעל מגנטי יכיל תאים CD45 +. התא נמוכה מספר: עבור הכבד שלם, המספר הכולל של CD133 + לא parenchymal מבודד עשוי להיות פחות מ -10,000. תאים אלה הם נדירים בכבד שקט. עבור דגם פציעה כרונית, כגון הדיאטה 0.1% DDC, המספר יגדל באופן משמעותי עד 100,000 תאים. אם מספר תא הכולל הוא נמוך משמעותית מספרים אלה, נושא אחד שצריך לקחת בחשבון הוא מכתים Ab FACS. בדוק כדי לוודא Ab CD133 אינו פג, כפי מכתים עניים תגרום תשואה גרועה. כמו כן, אנו ממליצים על ביצוע ניתוח FACS הלא parenchymal בתאי הכבד על מנת לקבוע את האוכלוסייה יחסית לפני בידוד FACS ניסיון. תא הכדאיות נמוכה לאחר FACS: אחת הבעיות של הקיום עשוי להיות קשור איך התאים מעובדים על פני זמן מה. באופן אידיאלי, התא כולו בידוד ההליך, צעדים 1-4, צריכה להתנהל ללא עיכובים בין השלבים וסיים באותו יום. כל עיכוב משמעותי בין שלבים 1-4 יהיה לצמצם במידה ניכרת את הכדאיות התא. בעיה שנייה הקשורה כדאיות התא עשויה להיות קשורה ללחץ נדן המשמש לבידוד FACS. אנו ממליצים להשתמש בלחץ נמוך נדן. לבסוף, לאחר תאים מבודדים, הם צריכים להיות מצופה מיד, כמו כל אחסון משמעותי על הקרח לאחר מיון יהיה גם להפחית את הכדאיות. CD133 + לא parenchymal ההטרוגניות: דיווחים אחרונים מצביעים על כך stellate תאים בכבד יכול להיות גם CD133 הביטוי יש פלסטיות. 25 לפיכך, בנוסף אימות עוצמה דו גנים עם אלבומין ו Krt19, אימות נוסף יכול לכלול גנים הקשורים בתאי stellate, כגון חלבון fibrillary גליה חומצי בתאי stellate שקט ו אלפא חלקה אקטין שרירים desmin בתאי stellate הופעל. 3,4,26 בנוסף, האוכלוסייה CD133 + מייצג אב באוכלוסייה רחבה יותר. תוספת של סמן שנייה, כגון EpCAM, עשוי לסייע לחדד את האוכלוסייה נוספת, ההטרוגניות גבול.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> DMEM: F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565-018 </td><td> עם פנול אדום </td></tr><tr><td> CD45 microbeads </td><td> Miltenyi </td><td> 130-052-301 </td><td></td></tr><tr><td> פקטור גדילה hepatocyte </td><td> סיגמא </td><td> H1404 </td><td></td></tr><tr><td> הצמיחה אפידרמיס גורם </td><td> סיגמא </td><td> E4127 </td><td></td></tr><tr><td> DNase </td><td> סיגמא </td><td> DN25 </td><td> 1 גרם </td></tr><tr><td> Collagenase D </td><td> רוש </td><td> 1088874 </td><td></td></tr><tr><td> Pronase </td><td> רוש </td><td> 0165921 </td><td></td></tr><tr><td> 70 מיקרון רשת מסננת </td><td> דיג </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Omniscript RT </td><td> Quaigen </td><td> 205111 </td><td> 50 תגובות </td></tr><tr><td> HotStarTaq </td><td> Quaigen </td><td> 203203 </td><td></td></tr><tr><td> Miltenyi טור LD </td><td> Miltenyi </td><td> 130-042-901 </td><td></td></tr><tr><td> CD133-PE FACS Ab </td><td> eBioscience </td><td> 12-1331-82 </td><td></td></tr><tr><td> Laminin צלחות מצופה </td><td> BD </td><td> 354410 </td><td> 96 גם </td></tr><tr><td> טריפסין 0.05% EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-354 </td><td> 100 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> RNeasy מיקרו Kit </td><td> Quaigen </td><td> 74004 </td><td> 50 עמודים עבור 5x10 5 תאים או פחות </td></tr><tr><td> פארם Lyse </td><td> BD </td><td> 555899 </td><td> 10X ריכוז </td></tr></tbody></table>

isolation of cd133+ liver stem cells for clonal expansion

גזע כבד התא, או התאים סגלגל, להתרבות במהלך פציעה כבד כרונית, והם הציעו להתמיין גם hepatocytes ו cholangiocytes. בנוסף, בתאי גזע בכבד הם שיערו להיות מבשרי עבור משנה של סרטן הכבד, סרטן Hepatocellular. אחד האתגרים העיקריים לבלום עבודה תא מוצק כמו כל איבר הכבד הוא בידודה של אוכלוסייה נדירה של תאים עבור ניתוח מפורט. למשל, הרוב המכריע של תאים בכבד הם hepatocytes (חלק parenchymal), אשר באופן משמעותי יותר מאשר אי - parenchymal תאים. על ידי העשרת תאים סלולריים ספציפי של הכבד (כלומר parenchymal ולא parenchymal שברים), ובחירה של תאים CD45 שלילי, אנו מסוגלים להעשיר את האוכלוסייה החל בתאי גזע על ידי למעלה מ 600-fold.The proceduresdetailed בדוח זה לאפשר אוכלוסייה נדירה יחסית של תאים מאיבר מוצק להיות מיון ביעילות. תהליך זה יכול להיות מנוצל כדי בתאי גזע isolateliver מהכבד Murine נורמלית, כמו גם פגיעה כרונית מודלים הכבד, אשר גדל להפגין גזע כבד התפשטות תאים. לשיטה זו יתרונות ברורים על פני אימונוהיסטוכימיה תקן של הכבד קבוע קפוא או פורמלין כפי מחקרים תפקודית באמצעות תאים חיים יכול להתבצע לאחר שיתוף לוקליזציה הניסויים הראשוניים. כדי לבצע את ההליך המתוארים בדוח זה, יחסים בעבודה עם ליבה מחקר מבוסס זרימה cytometry הוא מומלץ מאוד כמו הפרטים של בידוד FACS הם תלויים במידה רבה על מכשור מיוחדים ידע בסיסי חזק של זרימת cytometry נהלים בסיסיים. המטרה הספציפיים של התהליך הזה היא לבודד אוכלוסייה של גזע לתאי כבד כי ניתן להרחיב clonally במבחנה.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion at JoVE.com

Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion

כאן אנו מתארים את הבידוד של CD133 לבטא בתאי גזע כבד סרטן בתאי גזע מהכבד Murine שלם, תהליך הדורש עיכול רקמות, העשרה התא cytometry בידוד תזרים. אנו כוללים שיטות מתקדמות בידוד תא בודד והרחבת משובט.

בידוד של הכבד CD133 + בתאי גזע משובטים עבור הרחבת

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

בידוד והשתלות של בתאי גזע hematopoietic (HSCs)

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

בידוד הרחבת בקנה מידה גדול של תאים אנושיים למבוגרים האנדותל המושבה יצירת אב

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

בידוד בעלי חיים הרחבת חינם סרום של טבורי האדם נגזר תאים סטרומה mesenchymal (MSCs) ו האנדותל יצירת המושבה ובתאים (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

בידוד גזירת תאים עובריים בעכבר ז&#39;רמינל

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

בידוד של בתאי גזע xenografts סרטן הלבלב האנושי

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

בידוד של בלוטת הרוק עכבר תאים גזע

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

בידוד ותרבות של Myofibers פרט ותאי הלווין שלהם משרירי שלד למבוגרים

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

בידוד תאי גזע בוגרים נאיבי מתרבויות פיברובלסטים אנושיות הראשוניות

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

בידוד של hepatocytes האנושי על ידי שני שלבים Collagenase זלוף נוהל

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...