Name: isolation of cd133+ liver stem cells for clonal expansion
Uploaded: 2011-10-10T13:00:00
Duration: 12 min 6 s
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Dr. Rountree reconhece o actual apoio da Rede das Crianças Miracle, National Institute of Health, K08DK080928 e R03DK088013, ea American Cancer Society Award Scholar Research, MGO-11651. Dr. Rountree reconhece que este processo foi inicialmente desenvolvido e refinado, enquanto financiado pelo Programa Pediátrica Scientist Desenvolvimento (NICHD Grant Award K12-HD00850).

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	<li>Rountree, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CD133-expressing+murine+liver+oval+cell+population+with+bilineage+potential.">A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential.</a> Stem Cells. 25, 2419-2429 (2007).</li><li>Ding, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133++liver+cancer+stem+cells+from+methionine+adenosyl+transferase+1A-deficient+mice+demonstrate+resistance+to+transforming+growth+factor+(TGF)-beta-induced+apoptosis.">CD133+ liver cancer stem cells from methionine adenosyl transferase 1A-deficient mice demonstrate resistance to transforming growth factor (TGF)-beta-induced apoptosis.</a> Hepatology. 49, 1277-1286 (2009).</li><li>Rountree, C. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+hepatic+tumor+progenitor+cells+in+Pten-null+mice+requires+liver+injury+and+is+reversed+by+loss+of+AKT2.">Expansion of hepatic tumor progenitor cells in Pten-null mice requires liver injury and is reversed by loss of AKT2.</a> Gastroenterology. 139, 2170-2182 (2010).</li><li>Ding, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-to-mesenchymal+transition+of+murine+liver+tumor+cells+promotes+invasion.">Epithelial-to-mesenchymal transition of murine liver tumor cells promotes invasion.</a> Hepatology. 52, 945-953 (2010).</li></ol>

Dr. Rountree recebe apoio de pesquisa da Bayer Farmacêutica. Drs. Ding e Crooks e Ms. Dang e Ms. Vankirk não têm divulgações para relatar.

Ao contrário do sistema hematopoético, em que as células-tronco hematopoiéticas são responsáveis ​​por manter um sistema de diferenciação celular que replacesnormal fisiológicas turn-over de leucócitos, glóbulos vermelhos e plaquetas, células-tronco do fígado, ou células progenitoras adultas fígado, não participam de fígado normal homeostase. 5,6 Após lesão hepática aguda ou hepatectomia parcial, hepatócitos, epitélio como fígado diferenciados, passam por várias fases de proliferação para substituir a massa hepática perdido. 5,6 Somente durante lesão crônica são células-tronco do fígado observada a proliferar. 1,5 -11 Estes adultos, órgão células-tronco específicas são propostas para diferenciar-se em ambos os hepatócitos e cholangiocytes. 1,5-8 Curiosamente, a grande maioria de câncer de fígado desenvolve no fundo da lesão crônica, e, assim, as células-tronco do fígado também são hipótese a ser os precursores de um subconjunto de câncer de fígado. 2-4,12-17 Um dos grandes desafios para conter o trabalho celular no fígado é o isolamento de populações raras de células para análise funcional. Por exemplo, a grande maioria das células do fígado são hepatócitos, que são significativamente maiores do que cholangiocytes e outros menores não-parenquimatosa células. Quebrando todo o fígado em compartimentos celulares (hepatócitos grande - fração de parênquima e células menores - não-parenquimatosa fração), e ainda a seleção de células CD45 negativo (não-hematopoiéticas células), somos capazes de enriquecer a população a partir de células-tronco por mais de 600 vezes. 1,18-21 De notar que estamos de maneira nenhuma o que indica que a população + CD133 é um 100% da população de células-tronco pura, mas representa claramente uma população heterogênea de células, com diferentes linhagens e potencial de repovoamento. Uma das principais limitações do campo é definições de células-tronco e células progenitoras. Nós usamos a &quot;célula-tronco&quot; termo mais amplamente neste trabalho, mas em definição estrita, CD133 + não-parenquimatosa células representam uma população progenitora bi-linhagem. Dado o estado atual da haste e pesquisa de células progenitoras no fígado, este relatório não fornece um ponto de partida para os investigadores que estão interessados ​​neste campo. Como marcadores surgem novos, como EpCAM, 22,23 ou fatores de transcrição, tais como Sox9, 24 podem ser incorporados. Por exemplo, nós encontramos uma taxa bastante alta de sobreposição entre células EpCAM + e células CD133 +. Neste relatório, detalhamos um processo para isolamento de células-tronco do fígado de camundongos normais, bem como modelos de lesão crônica no fígado, que demonstram um aumento da proliferação de células-tronco do fígado. Este método tem vantagens claras sobre imuno-histoquímica padrão de congelados ou formol fígado fixado como estudos funcionais utilizando células vivas podem ser realizadas após o isolamento. 1,3,4 O objetivo específico deste processo é isolar uma população relativamente pura de células tronco do fígado que pode clonalmente ser expandidas in vitro. A principal limitação para este procedimento é que a maioria das células isoladas não será viável após a citometria de fluxo (ver secção Resolução de Problemas). Este é o resultado de as horas necessárias para preparar as células, e os inúmeros procedimentos necessários para refinar a população antes de isolamento. Se o fígado é digerido em suspensão única célula para análise FACS imediato, a diferença de tamanho entre os hepatócitos e outras células não-parenquimatosas fará criação portão eficaz FACS impossível. Se o fígado não-parenquimatosa células são utilizadas, sem eliminação de células hematopoiéticas, há um risco de que um número significativo de células CD133 + pode ser de origem hematopoiéticas podem contaminar a fração. Além disso, através do processamento das células através do filtro Miltenyi, apenas uma única célula e clusters muito pequena de células são coletadas. Isso garante que a amostra não vai entupir a agulha ingestão FACS. Alternativas para este procedimento incluem a modificação de qualquer marcador alternativa da superfície celular, tais como CD49f, EpCAM, ou a combinação de marcadores, como CD133 + + EpCAM Um segundo relatório publicado utiliza um gradiente de densidade para isolar células-tronco do fígado de uma fração não-parenquimatosas. Este procedimento requer uma centrífuga Ultra-(8000 xg), acrescenta um tempo significativo para o procedimento, e em nossa experiência, reduziu significativamente o rendimento pré-FACS celular e pós-FACS viabilidade 8. Experimentos futuros incluem uma ampla gama de análise de expressão gênica, incluindo genes do fígado fetal, tais como HNF3, HNF4α, e além αfp.In, análise de Western blot e imunocitoquímica das proteínas expressas podem ser utilizados para confirmar a RT-PCR, os resultados de células em cultura. Uma questão a se notar é um trabalho recente que identificou CD133 expressão em células estreladas hepáticas. 25 Nós agora rotineiramente tela nossas amostras para os marcadores de células estreladas (ver secção Resolução de Problemas), e não identified contaminação significativa no nosso frações. Isso pode estar relacionado com as diferentes técnicas de digestão do fígado e do isolamento de células. 2,3,26 Baseado no fato de que a maioria das células não vai ser viável imediatamente após o isolamento FACS, recomendamos que as células sejam banhados, seja como massa CD133 + células ou células isoladas, antes da sua utilização em animais. 5-7 dias in vitro irá melhorar significativamente os resultados da análise do tumor. Além disso, dado os rigores de isolamento única célula, este deverá ser realizado apenas uma vez colônias pode ser expandida a partir de CD133 + granel células isoladas. Uma discussão mais aprofundada das condições de cultivo e várias proteínas de andaime que podem ser utilizadas para conter a cultura do fígado e células progenitoras foi bem caracterizada por Lola Reid. Este trabalho oferece condições alternativas e modificações, que os investigadores podem incorporar em seu programa de pesquisa uma vez que técnicas de isolamento básicos são dominados. 27,28 Dr. Trabalho de Reid também fornece uma análise mais detalhada da biologia linhagem e maturação entre as células-tronco e progenitores hepática comprometida. Em termos de análise de tumor in vivo, temos tido sucesso usando recém células isoladas e células de expansão clonal CD133 + células in vitro, usando principalmente 1x10 6 células. Nós nos concentramos cepas ontwo genética de lesão hepática crônica, a MAT1a - / - e PTEN específica do fígado - / - ratos, e nós utilizamos camundongos nude e camundongos selvagens como hospedeiros de crescimento do tumor. Em nossa experiência, CD133 + células-tronco do fígado só vai formar tumores se eles são isolados a partir de modelos hepática significativa lesão que são pré-malignas. Note-se que os tumores formados a partir de células CD133 + geral têm tanto carcinoma hepatocelular e características colangiocarcinoma, sugerindo uma célula-tronco ou células progenitoras origem aos tumores. 2-4,29 Trabalho de acompanhamento após tumores são documentados inclui a análise patológica padrão de tecido tumoral (coloração H &amp; E) e coloração imuno-histoquímica. Além disso, os tumores podem ser picadas e digeridas para FACS análise ou re-cultura. 2-4,30 Em conclusão, temos um procedimento detalhado para o isolamento, expansão e caracterização básica de CD133 + células tronco do fígado e CD133 + células-tronco cancerosas. Resolução de Problemas: CD45 contaminação: Para o Passo 3, se houver contaminação do CD45 células +, que pode ser avaliado pela adição de um Ab CD45-FITC antes FACS análise e isolamento, verifique se o anticorpo microbead CD45 não expirou e que o filtrado foi coletado somente enquanto o filtro foi no suporte magnético. Qualquer filtrado recolhido enquanto que o filtro não está no suporte magnético irá conter células CD45 +. Número de células de baixa: Para o fígado sem ferimentos, o número total de CD133 + não-parenquimatoso isolado pode ser inferior a 10.000. Estas células são raras no fígado quiescente. Para um modelo de lesão crônica, tais como a dieta DDC 0,1%, o número irá aumentar enormemente a 100.000 células. Se o número total de células é significativamente abaixo desses números, uma questão a considerar é o FACS coloração Ab. Verifique para garantir que o Ab CD133 não expirou, como coloração pobres irá resultar em um rendimento pobre. Além disso, recomendamos realizar uma análise FACS do fígado não-parenquimatosa células para determinar a população relativa antes de tentar o isolamento FACS. Viabilidade celular baixa após FACS: Uma das questões de viabilidade pode ser relacionado à forma como as células são processadas e sobre o que o tempo. Idealmente, todo o procedimento de isolamento de células, os passos 1-4, deve ser realizada sem atrasos entre as etapas e concluída no mesmo dia. Qualquer atraso significativo entre os passos 1-4 irá reduzir significativamente a viabilidade celular. Uma segunda questão relacionada com a viabilidade das células podem estar relacionados à pressão bainha utilizado para o isolamento FACS. Recomendamos a utilização de uma menor pressão bainha. Por último, uma vez que as células são isoladas, elas devem ser imediatamente banhado, como qualquer armazenamento significativo no gelo após a triagem também irá reduzir sua viabilidade. CD133 + não-parenquimatosa heterogeneidade: Relatórios recentes indicam que as células estreladas hepáticas também podem ter CD133 expressão e ter alguma plasticidade. 25 Por isso, além de verificar a potência bi-genes com albumina e Krt19, verificação adicional pode incluir genes associados com as células estreladas, como a proteína fibrilar glial ácida em células estreladas quiescentes e alfa-actina de músculo liso e desmina em células estreladas ativadas. 3,4,26 Além disso, a população CD133 + representa uma população mais ampla progenitor. A adição de um segundo marcador, como EpCAM, pode ajudar a refinar ainda mais a população, e heterogeneidade limite.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> DMEM: F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565-018 </td><td> Com vermelho de fenol </td></tr><tr><td> CD45 microesferas </td><td> Miltenyi </td><td> 130-052-301 </td><td></td></tr><tr><td> Fator de Crescimento do hepatócito </td><td> Sigma </td><td> H1404 </td><td></td></tr><tr><td> Fator de Crescimento Epidérmico </td><td> Sigma </td><td> E4127 </td><td></td></tr><tr><td> DNase </td><td> Sigma </td><td> DN25 </td><td> 1 grama </td></tr><tr><td> Colagenase D </td><td> Roche </td><td> 1088874 </td><td></td></tr><tr><td> Pronase </td><td> Roche </td><td> 0165921 </td><td></td></tr><tr><td> 70 micron filtro de malha </td><td> Pescador </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Omniscript RT </td><td> Quaigen </td><td> 205111 </td><td> 50 reações </td></tr><tr><td> HotStarTaq </td><td> Quaigen </td><td> 203203 </td><td></td></tr><tr><td> Miltenyi coluna LD </td><td> Miltenyi </td><td> 130-042-901 </td><td></td></tr><tr><td> CD133-PE FACS Ab </td><td> eBioscience </td><td> 12-1331-82 </td><td></td></tr><tr><td> Placas revestidas laminina </td><td> BD </td><td> 354410 </td><td> 96 poços </td></tr><tr><td> Tripsina EDTA 0,05% </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-354 </td><td> 100 mL </td></tr><tr><td> RNeasy Micro Kit </td><td> Quaigen </td><td> 74004 </td><td> 50 colunas de 5x10 5 células ou menos </td></tr><tr><td> Pharm Lyse </td><td> BD </td><td> 555899 </td><td> Concentração 10X </td></tr></tbody></table>

isolation of cd133+ liver stem cells for clonal expansion

Células-tronco do fígado, ou células ovais, proliferam durante a lesão hepática crônica, e são propostas para se diferenciar em ambos os hepatócitos e cholangiocytes. Além disso, as células-tronco do fígado são a hipótese de ser os precursores de um subconjunto de câncer de fígado, carcinoma hepatocelular. Um dos principais desafios para conter trabalho em células de qualquer órgão sólido como o fígado é o isolamento de uma população rara de células para análise detalhada. Por exemplo, a grande maioria das células do fígado são hepatócitos (fração parenquimatosa), que são significativamente maiores do que os não-parenquimatosa células. Através do enriquecimento das compartimentos específicos celulares do fígado (ou seja, parenquimatosas e não parenquimatosas frações), e selecionando para CD45 células negativas, somos capazes de enriquecer a população a partir de células-tronco por mais de 600 fold.The proceduresdetailed neste relatório permitem uma população relativamente raro de células de um órgão sólido a ser classificado de forma eficiente. Este processo pode ser utilizado para as células-tronco do fígado murino isolateliver normal, assim como modelos de lesão crônica no fígado, que demonstram um aumento da proliferação de células-tronco do fígado. Este método tem vantagens claras sobre imuno-histoquímica padrão de congelados ou formol fígado fixado como estudos funcionais utilizando células vivas podem ser realizadas após a primeira co-localização experimentos. Para realizar o procedimento descrito neste relatório, uma relação de trabalho com uma pesquisa do núcleo de citometria de fluxo baseado é fortemente encorajado, como os detalhes de isolamento FACS são altamente dependentes de instrumentos especializados e um forte conhecimento de básico citometria de fluxo dos procedimentos. O objetivo específico deste processo é isolar uma população de células-tronco do fígado que pode ser expandida clonal in vitro.

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Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion

Aqui nós descrevemos o isolamento de células do fígado CD133 expressando-tronco e células-tronco do câncer de fígado murino todo, um processo que requer a digestão dos tecidos, o enriquecimento de células eo isolamento de citometria de fluxo. Nós incluem métodos para o isolamento de células avançado única e expansão clonal.

Isolamento de CD133 + células tronco do fígado de Expansão Clonal

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In ...

Research

JoVE Journal

Biology

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Biologia

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

Isolamento e expansão em grande escala de Adulto Humanos endotelial Colony Células Progenitoras Forming

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

Isolamento e animais de Expansão de soro livre de cordão umbilical humano Derivado células mesenquimais estromais (MSCs) e endoteliais Células Progenitoras Colony Forming (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

Isolamento e derivação de células embrionárias de rato Germinal

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Isolamento de células-tronco de xenoenxertos Humano do Câncer de pâncreas

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Isolamento de Células-Tronco do rato das Glândulas Salivares

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolamento e Cultura de miofibras individuais e suas células satélites do músculo esquelético

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Naïve Adult Stem Cells isolamento de culturas primárias de fibroblastos humanos

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Indução e Análise de epitelial para mesenquimal Transição

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

Isolamento de hepatócitos humanos por duas etapas Collagenase Perfusão Procedimento

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...