Name: study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing gfp-actin
Uploaded: 2011-11-18T13:00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin at JoVE.com

Den GFP-β-actin plasmid blev gavmildt leveret af Dr. Wayne Orr, LSUHSC-S Institut for Patologi, og blev forstærket i laboratoriet af Dr. Becky Worthylake, LSUHSC-NO Institut for Farmakologi. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (P20 RR-018766) og American Heart Association (05835386N).

<ol>
	<li>Spindler, V., Schlegel, N., Waschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+GTPases+in+control+of+microvascular+permeability.">Role of GTPases in control of microvascular permeability.</a> Cardiovasc. Res. 87, 243-253 (2010).</li><li>Wojciak-Stothard, B., Ridley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+GTPases+and+the+regulation+of+endothelial+permeability.">Rho GTPases and the regulation of endothelial permeability.</a> Vascul. Pharmacol. 39, 187-199 (2002).</li><li>Yuan, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+pathways+in+enhanced+microvascular+permeability.">Signal transduction pathways in enhanced microvascular permeability.</a> Microcirculation. 7, 395-403 (2000).</li><li>Birukov, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+GTPases+in+mechanosensitive+regulation+of+endothelial+barrier.">Small GTPases in mechanosensitive regulation of endothelial barrier.</a> Microvasc. Res. 77, 46-52 (2009).</li><li>Duran, W. N., Sanchez, F. A., Breslin, J. W., Tuma, R. F., Duran, W. N., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculatory+Exchange+Function.">Microcirculatory Exchange Function.</a> Handbook of Physiology: Microcirculation. , 81-124 (2008).</li><li>Hu, Y. L., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+motion+of+paxillin+on+actin+filaments+in+living+endothelial+cells.">Dynamic motion of paxillin on actin filaments in living endothelial cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 357, 871-876 (2007).</li><li>Borm, B., Requardt, R. P., Herzog, V., Kirfel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+ruffles+in+cell+migration:+indicators+of+inefficient+lamellipodia+adhesion+and+compartments+of+actin+filament+reorganization.">Membrane ruffles in cell migration: indicators of inefficient lamellipodia adhesion and compartments of actin filament reorganization.</a> Exp. Cell. Res. 302, 83-95 (2005).</li><li>Hotulainen, P., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+fibers+are+generated+by+two+distinct+actin+assembly+mechanisms+in+motile+cells.">Stress fibers are generated by two distinct actin assembly mechanisms in motile cells.</a> J. Cell. Biol. 173, 383-394 (2006).</li><li>Pellegrin, S., Mellor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+stress+fibres.">Actin stress fibres.</a> J. Cell. Sci. 120, 3491-3499 (2007).</li><li>Ballestrem, C., Wehrle-Haller, B., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+dynamics+in+living+mammalian+cells.">Actin dynamics in living mammalian cells.</a> J. Cell. Sci. 111, 1649-1658 (1998).</li><li>Helmke, B. P., Rosen, A. B., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+mechanical+strain+of+an+endogenous+cytoskeletal+network+in+living+endothelial+cells.">Mapping mechanical strain of an endogenous cytoskeletal network in living endothelial cells.</a> Biophys. J. 84, 2691-2699 (2003).</li><li>Birukova, A. A., Smurova, K., Birukov, K. G., Kaibuchi, K., Garcia, J. G., Verin, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Rho+GTPases+in+thrombin-induced+lung+vascular+endothelial+cells+barrier+dysfunction.">Role of Rho GTPases in thrombin-induced lung vascular endothelial cells barrier dysfunction.</a> Microvasc. Res. 67, 64-77 (2004).</li><li>van Nieuw Amerongen, G. P., van Delft, S., Vermeer, M. A., Collard, J. G., van Hinsbergh, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+RhoA+by+thrombin+in+endothelial+hyperpermeability:+role+of+Rho+kinase+and+protein+tyrosine+kinases.">Activation of RhoA by thrombin in endothelial hyperpermeability: role of Rho kinase and protein tyrosine kinases.</a> Circ. Res. 87, 335-340 (2000).</li><li>Moy, A. B., Blackwell, K., Kamath, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+histamine+and+thrombin+on+endothelial+barrier+function+through+actin-myosin+tension.">Differential effects of histamine and thrombin on endothelial barrier function through actin-myosin tension.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 282, H21-H29 (2002).</li><li>Wittman, T., Littlefield, R., Waterman-Storer, C., Goldman, R. D., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+speckle+microscopy+of+cytoskeletal+dynamics+in+living+cells.">Fluorescent speckle microscopy of cytoskeletal dynamics in living cells.</a> Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , 184-204 (2005).</li><li>Rabut, G., Ellenberg, J., Goldman, R. D., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells:+FRAP,+iFRAP,+and+FLIP.">Photobleaching techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, iFRAP, and FLIP.</a> Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , 101-126 (2005).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklæret.

De billeder af GFP-actin i levende endotelceller muliggør en detaljeret analyse af dynamikken i actin cytoskeleton som reaktion på inflammatoriske stimuli. Denne metode kan også være nyttigt at bygge videre på tidligere resultater viser ombygning af cytoskeleton som reaktion på fysiske kræfter som forskydningsspænding 11. Desuden giver denne metode en detaljeret vurdering af bidraget fra actin cytoskeletal dynamik til forskellige endotelceller aktiviteter, herunder migration, mitose, dannelse af intercellulære vejkryds og Junctional modning og vedligeholdelse af barrierefunktion. I de viste data, kan opførslen af ​​endotel actin cytoskeleton iagttages før og efter behandling med thrombin. Lokale lamellipodia langs hele kanten af ​​endotelceller blev observeret formgivning og regressing over tid i både nonconfluent og sammenflydende celle monolag. Behandling med thrombin kortvarigt afbrudt lamellipodia formulartion og omsætning. Trombin forårsagede også cellerne til kontrakten lidt efter aftale med tidligere rapporter om, at thrombin forårsager aktin stress fiber dannelse og øget centripetale spænding udviklingen i endotelceller 12-14. Men fra levende celler billeddiagnostiske undersøgelser som denne, kan oprindelsen af ​​stress fibre nu bestemmes. I HUVEC, stammer de fleste af stress fibre på cellen periferien og ligner tværgående bue fibre for overgangen celler 8, 9. En anden styrke ved denne metode frem ved hjælp af faste celler er, at antallet af stress fibre kan kvantificeres i individuelle celler før og efter trombin behandling, eliminere selektionsbias mellem eksperimentelle grupper. Med denne protokol, vi evaluerer dynamisk bevægelse af cellen kant og aktin stress fibre. For at forstå aktin monomere dynamik i endotelceller, mere avancerede teknikker såsom fluorescens bedring efter fotoblegning (FRAP) eller fluorescens speckle Microskopi (MFS) kan anvendes 15, 16. Hertil kommer, mikrovaskulære endotelceller da kan udgøre en bedre model af mikrovaskulære barrierefunktion, optimering af transfektion protokoller til effektivt at udtrykke GFP-actin i mikrovaskulære endotelceller repræsenterer en logisk fremtidige retning. Sammenfattende repræsenterer billedbehandling af levende endothelceller udtrykker GFP-aktin et kraftfuldt værktøj til at bestemme, hvordan endotelceller actin cytoskeleton reagerer på forskellige former for stimuli. Undersøgelser med stramt sammenflydende endotel monolag vil hjælpe med at bestemme de roller, som dynamiske strukturer såsom aktin-rige lamellipodia og tværgående bue stress fibre i endotel barriere funktion. Desuden vil leve cell imaging af endothelceller udtrykker GFP-aktin eller anden fusion proteiner, som tillader visualisering af andre subcellulære strukturer giver detaljerede Spatiotemporal nødvendige oplysninger for at forstå signaler og strukturelle mekanismer, der determine barriere integritet.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> 1. Ringer 5x Stock </td></tr><tr><td> Kemisk </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Beløb </td></tr><tr><td> Sodium Chloride </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 35 g </td></tr><tr><td> Kaliumklorid </td><td> JT Baker </td><td> 3040 </td><td> 1,75 g </td></tr><tr><td> Calcium Chloride </td><td> Sigma </td><td> C-3881 </td><td> 1,47 g </td></tr><tr><td> Magnesium Sulfate </td><td> Sigma </td><td> M-9397 </td><td> 1,44 g </td></tr><tr><td> Sterile filtreret vand </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Bring til 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Steril filter i autoklaveres flasker og gemmer ved 4 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 2. MOPS buffer </td></tr><tr><td> Kemisk </td><td>Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Beløb </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> Sigma </td><td> M3183 </td><td> 125,6 g </td></tr><tr><td> Sterile filtreret vand </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Bring til 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Steril filter i autoklaveres flasker og gemmer ved 4 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 3. Albumin Fysiologiske Salt Solution (APSS) </td></tr><tr><td> Kemisk </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Beløb </td></tr><tr><td> Ringer materiel (5x) </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> Mops Buffer </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Natrium Fosfat </td><td> Sigma </td><td> S-9638 </td><td> 0,168 g </td></tr><tr><td> Sodium Pyruvat &lt;/ Td&gt; <td> Sigma </td><td> P5280 </td><td> 0,22 g </td></tr><tr><td> EDTA natriumsalt </td><td> Sigma </td><td> ED2SS </td><td> 0,0074 g </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td> 0,901 g </td></tr><tr><td> Albumin, Bovin </td><td> USB </td><td> 10856 </td><td> 10 g </td></tr><tr><td> Sterile filtreret vand </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Bring til 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Justér pH til 7,4 ved 37 ° C, så sterilt filter i autoklaveres flasker og opbevares ved 4 ° C. </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 4. 0,9% saltvand </td></tr><tr><td> Kemisk </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Beløb </td></tr><tr><td> Sodium Chloride </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 9 g </td></tr><tr><td> Sterile filtreret vand </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Bring til 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Steril filter i autoklaveres flasker og gemmer ved 4 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 5. 1,5% Gelatine Solution </td></tr><tr><td> Gelatine fra svin hud </td><td> Sigma </td><td> G2500 </td><td> 15 g </td></tr><tr><td> 0,9% saltvand </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Bring til 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Varm løsningen på 37 ° C for at opløse gelatine tilstrækkeligt. Mens stadig varm, sterilt filter i autoklaveres flasker og opbevares ved 4 ° C </td></tr></tbody></table>

study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing gfp-actin

Det mikrovaskulære endothelium spiller en vigtig rolle som et selektivt permeabel barriere for væsker og opløste stoffer. Limen kryds mellem endotelceller regulere permeabilitet endotelet, og mange undersøgelser har vist det vigtige bidrag actin cytoskeleton at afgøre Junctional integritet 1-5. En cortical aktin bælte menes at være vigtigt for opretholdelsen af stabile vejkryds 1, 2, 4, 5. I modsætning hertil er actin stress fibre menes at generere centripetale spændinger i endotelceller, der svækker vejkryds 2-5. Meget af denne teori er baseret på studier, hvor endothelceller behandles med inflammatoriske mediatorer kendt for at øge endotel permeabilitet, og derefter om fastsættelse af celler og mærkning af F-aktin til mikroskopisk observation. Men disse undersøgelser giver en meget begrænset forståelse af den rolle, de actin cytoskeleton fordi billeder af faste celler giver kun snapshots itid sammen med nogen oplysninger om dynamikken i aktin strukturer 5. Live-cell imaging tillader inkorporering af den dynamiske karakter af actin cytoskeleton ind i studier af de mekanismer, der tjener endothelial barriere integritet. En stor fordel ved denne metode er, at effekten af ​​forskellige inflammatoriske stimuli på aktin strukturer i endotelceller kan vurderes i det samme sæt af levende celler før og efter behandlingen, at fjerne potentielle bias, som kan opstå, når observere faste prøver. Menneskelige navlestrengen vene endotelceller (HUVEC) er transficeret med et GFP-β-aktin plasmid og vokset til sammenløbet på glas dækglas. Time-lapse billeder af GFP-actin i sammenflydende HUVEC er fanget før og efter tilsætning af inflammatoriske mediatorer, der kan udløse tidsafhængige ændringer i endothelial barriere integritet. Disse undersøgelser muliggøre en visuel observation af væsken sekvens af ændringer i actin cytoskeleton, der bidrager til endothelial barriere forstyrrelser og restaurering. Vores resultater viser konsekvent lokale, aktin-rige lamellipodia dannelse og omsætning i endothelceller. Dannelsen og flytning af actin stress fibre kan også ses. En analyse af hyppigheden af ​​dannelse og omsætning af den lokale lamellipodia, før og efter behandling med inflammatoriske stimuli kan dokumenteres ved kymograph analyser. Disse undersøgelser giver vigtige oplysninger om den dynamiske karakter af actin cytoskeleton i endotelceller, der kan bruges til at opdage hidtil uidentificerede molekylære mekanismer vigtige for opretholdelsen af ​​endothelial barriere integritet.

Watch this Scientific Journal Video about Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin at JoVE.com

Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

Mikroskopisk billedbehandling af levende endothelceller udtrykker GFP-aktin tillader karakterisering af dynamiske ændringer i cytoskeletal strukturer. I modsætning til teknikker, der anvender faste prøver, giver denne metode en detaljeret vurdering af tidsmæssige ændringer i actin cytoskeleton i de samme celler før, under og efter forskellige fysiske, farmakologiske eller inflammatoriske stimuli.

Undersøgelse af Actin cytoskeleton i Live endoteliale celler, der udtrykker GFP-Actin

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

The Cytoskeleton I: Actin and Microfilaments

SCIENTISTS IN ACTION

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Gør-det-selv enhed for inddrivelse af Kryopræserverede Prøver uheld faldt i Kryogene lagertanke

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Levende Imaging af Apoptotisk Cell Clearance under<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Intravital mikroskopi af Imaging Subcellulære Strukturer Live mus, der udtrykker fluorescerende proteiner

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Endotelcelle Tube Opstilling assay for<em&gt; In Vitro</em&gt; Undersøgelse af angiogenese

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolering af murint Ventil endotelceller

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...