Name: study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing gfp-actin
Uploaded: 2011-11-18T13:00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin at JoVE.com

GFP-β-אקטין פלסמיד סופק בנדיבות על ידי ד&quot;ר ווין אור, LSUHSC-S המחלקה לפתולוגיה, והיה מוגבר במעבדה של ד&quot;ר בקי Worthylake, LSUHSC-NO המחלקה לפרמקולוגיה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות (P20 RR-018766) ואת איגוד הלב האמריקני (05835386N).

<ol>
	<li>Spindler, V., Schlegel, N., Waschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+GTPases+in+control+of+microvascular+permeability.">Role of GTPases in control of microvascular permeability.</a> Cardiovasc. Res. 87, 243-253 (2010).</li><li>Wojciak-Stothard, B., Ridley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+GTPases+and+the+regulation+of+endothelial+permeability.">Rho GTPases and the regulation of endothelial permeability.</a> Vascul. Pharmacol. 39, 187-199 (2002).</li><li>Yuan, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+pathways+in+enhanced+microvascular+permeability.">Signal transduction pathways in enhanced microvascular permeability.</a> Microcirculation. 7, 395-403 (2000).</li><li>Birukov, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+GTPases+in+mechanosensitive+regulation+of+endothelial+barrier.">Small GTPases in mechanosensitive regulation of endothelial barrier.</a> Microvasc. Res. 77, 46-52 (2009).</li><li>Duran, W. N., Sanchez, F. A., Breslin, J. W., Tuma, R. F., Duran, W. N., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculatory+Exchange+Function.">Microcirculatory Exchange Function.</a> Handbook of Physiology: Microcirculation. , 81-124 (2008).</li><li>Hu, Y. L., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+motion+of+paxillin+on+actin+filaments+in+living+endothelial+cells.">Dynamic motion of paxillin on actin filaments in living endothelial cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 357, 871-876 (2007).</li><li>Borm, B., Requardt, R. P., Herzog, V., Kirfel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+ruffles+in+cell+migration:+indicators+of+inefficient+lamellipodia+adhesion+and+compartments+of+actin+filament+reorganization.">Membrane ruffles in cell migration: indicators of inefficient lamellipodia adhesion and compartments of actin filament reorganization.</a> Exp. Cell. Res. 302, 83-95 (2005).</li><li>Hotulainen, P., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+fibers+are+generated+by+two+distinct+actin+assembly+mechanisms+in+motile+cells.">Stress fibers are generated by two distinct actin assembly mechanisms in motile cells.</a> J. Cell. Biol. 173, 383-394 (2006).</li><li>Pellegrin, S., Mellor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+stress+fibres.">Actin stress fibres.</a> J. Cell. Sci. 120, 3491-3499 (2007).</li><li>Ballestrem, C., Wehrle-Haller, B., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+dynamics+in+living+mammalian+cells.">Actin dynamics in living mammalian cells.</a> J. Cell. Sci. 111, 1649-1658 (1998).</li><li>Helmke, B. P., Rosen, A. B., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+mechanical+strain+of+an+endogenous+cytoskeletal+network+in+living+endothelial+cells.">Mapping mechanical strain of an endogenous cytoskeletal network in living endothelial cells.</a> Biophys. J. 84, 2691-2699 (2003).</li><li>Birukova, A. A., Smurova, K., Birukov, K. G., Kaibuchi, K., Garcia, J. G., Verin, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Rho+GTPases+in+thrombin-induced+lung+vascular+endothelial+cells+barrier+dysfunction.">Role of Rho GTPases in thrombin-induced lung vascular endothelial cells barrier dysfunction.</a> Microvasc. Res. 67, 64-77 (2004).</li><li>van Nieuw Amerongen, G. P., van Delft, S., Vermeer, M. A., Collard, J. G., van Hinsbergh, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+RhoA+by+thrombin+in+endothelial+hyperpermeability:+role+of+Rho+kinase+and+protein+tyrosine+kinases.">Activation of RhoA by thrombin in endothelial hyperpermeability: role of Rho kinase and protein tyrosine kinases.</a> Circ. Res. 87, 335-340 (2000).</li><li>Moy, A. B., Blackwell, K., Kamath, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+histamine+and+thrombin+on+endothelial+barrier+function+through+actin-myosin+tension.">Differential effects of histamine and thrombin on endothelial barrier function through actin-myosin tension.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 282, H21-H29 (2002).</li><li>Wittman, T., Littlefield, R., Waterman-Storer, C., Goldman, R. D., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+speckle+microscopy+of+cytoskeletal+dynamics+in+living+cells.">Fluorescent speckle microscopy of cytoskeletal dynamics in living cells.</a> Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , 184-204 (2005).</li><li>Rabut, G., Ellenberg, J., Goldman, R. D., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells:+FRAP,+iFRAP,+and+FLIP.">Photobleaching techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, iFRAP, and FLIP.</a> Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , 101-126 (2005).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הדמיה של ה-GFP-אקטין בתאי אנדותל לחיות מאפשר ניתוח מפורט של הדינמיקה של cytoskeleton אקטין בתגובה לגירויים דלקתיים. שיטה זו עשויה להיות שימושית גם לבנות על ממצאים קודמים מראה שיפוץ cytoskeleton בתגובה כוחות פיזיים כמו מתח גזירה 11. בנוסף, שיטה זו מאפשרת הערכה מפורטת של התרומה של הדינמיקה אקטין cytoskeletal על פעילויות שונות תא האנדותל, כולל הגירה, מיטוזה, היווצרות של צמתים אינטר והתבגרות junctional, תפקוד ותחזוקה של המכשול. ב הנתונים המוצגים, התנהגותם של cytoskeleton אקטין אנדותל ניתן לראות לפני ואחרי הטיפול עם תרומבין. Lamellipodia מקומי כל בשולי לתאי אנדותל נצפו להרכיב רגרסיה לאורך זמן monolayers התא הן nonconfluent ומחוברות. טיפול עם תרומבין בקצרה קטע טופס lamellipodiaation מחזור. טרומבין גם גרמה לתאים להתכווץ מעט, בהסכמה עם דיווחים קודמים כי תרומבין גורמת ללחץ סיבי אקטין היווצרות מתח מוגבר להתפתחות צנטריפטלי בתאי אנדותל 12-14. עם זאת, מן המחקרים תא חי הדמיה כגון זה, מקורם של הסיבים הלחץ כעת ניתן נחוש. ב HUVEC, רוב הסיבים מתח מקורן בשולי התא דומה סיבי קשת רוחבי של תאים נודדים 8, 9. כוח נוסף של שיטה זו על פני שימוש בתאים קבועים שמספר סיבי המתח ניתן לכמת בתאים בודדים לפני ואחרי הטיפול תרומבין, ביטול הטיית בחירה בין קבוצות הניסוי. באמצעות פרוטוקול זה אנו מעריכים תנועה דינמית של קצה תא הלחץ סיבי אקטין. כדי להבין את הדינמיקה מונומר אקטין בתאי אנדותל, טכניקות מתקדמות יותר כגון התאוששות הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) או פלואורסצנטי רבב מיקרועותק (FSM) יכול להיות מיושם 15, 16. בנוסף, בגלל כלי הדם לתאי אנדותל יכול לייצג מודל טוב יותר של תפקוד מחסום כלי הדם, אופטימיזציה של פרוטוקולים transfection לבטא בצורה יעילה GFP-אקטין בתאי אנדותל כלי הדם מייצג הכיוון העתידי הגיוני. לסיכום, הדמיה של בתאי האנדותל לחיות להביע GFP-אקטין מהווה כלי רב עוצמה כדי לקבוע כיצד cytoskeleton אקטין תא האנדותל מגיב סוגים שונים של גירויים. מחקרים באמצעות monolayers אנדותל ומחוברות היטב תסייע לקבוע את התפקידים של מבנים דינמיים כגון אקטין עשיר lamellipodia ו רוחבי מתח קשת סיבים בתפקוד האנדותל מחסום. בנוסף, הדמיה של תא חי לתאי אנדותל להביע GFP-אקטין או חלבונים היתוך אחרים המאפשרים הדמיה של מבנים subcellular אחרים יספק מידע spatiotemporal מפורט כדי להבין את מנגנוני איתות מבניים דetermine שלמות המכשול.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="4"> 1. רינגר 5x במלאי </td></tr><tr><td> כימי </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוג </td><td> כמות </td></tr><tr><td> נתרן כלוריד </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 35 גרם </td></tr><tr><td> אשלגן כלוריד </td><td> JT בייקר </td><td> 3040 </td><td> 1.75 גר &#39; </td></tr><tr><td> סידן כלוריד </td><td> סיגמא </td><td> C-3881 </td><td> 1.47 גר &#39; </td></tr><tr><td> מגנזיום סולפט </td><td> סיגמא </td><td> M-9397 </td><td> 1.44 גר &#39; </td></tr><tr><td> מים מסוננים ועיקור </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> מביאים L 1 </td></tr><tr><td colspan="4"> סינון סטרילי לתוך בקבוקים חנויות autoclaved ב 4 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 2. מגבים חיץ </td></tr><tr><td> כימי </td><td>חברה </td><td> מספר קטלוג </td><td> כמות </td></tr><tr><td> מגבים </td><td> סיגמא </td><td> M3183 </td><td> 125.6 גרם </td></tr><tr><td> מים מסוננים ועיקור </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> מביאים L 1 </td></tr><tr><td colspan="4"> סינון סטרילי לתוך בקבוקים חנויות autoclaved ב 4 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 3. הפתרון אלבומין מלח פיזיולוגיים (APSS) </td></tr><tr><td> כימי </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוג </td><td> כמות </td></tr><tr><td> רינגר מניות (5x) </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 200 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> מגבים הצפת </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> סודיום פוספט </td><td> סיגמא </td><td> S-9638 </td><td> 0.168 גרם </td></tr><tr><td> Pyruvate נתרן &lt;/ Td&gt; <td> סיגמא </td><td> P5280 </td><td> 0.22 גר &#39; </td></tr><tr><td> מלח נתרן EDTA </td><td> סיגמא </td><td> ED2SS </td><td> 0.0074 גרם </td></tr><tr><td> גלוקוז </td><td> סיגמא </td><td> G7528 </td><td> 0.901 גרם </td></tr><tr><td> אלבומין, שור </td><td> USB </td><td> 10856 </td><td> 10 גרם </td></tr><tr><td> מים מסוננים ועיקור </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> מביאים L 1 </td></tr><tr><td colspan="4"> התאם את ה-pH 7.4 בשעה 37 ° C, ואז לסנן לתוך בקבוקים סטריליים autoclaved ולאחסן ב 4 ° C. </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 4. 0.9% Saline </td></tr><tr><td> כימי </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוג </td><td> כמות </td></tr><tr><td> נתרן כלוריד </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 9 גרם </td></tr><tr><td> מים מסוננים ועיקור </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> מביאים L 1 </td></tr><tr><td colspan="4"> סינון סטרילי לתוך בקבוקים חנויות autoclaved ב 4 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 5. הפתרון לטין 1.5% </td></tr><tr><td> לטין מהעור חזירי </td><td> סיגמא </td><td> G2500 </td><td> 15 גרם </td></tr><tr><td> 0.9% Saline </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> מביאים L 1 </td></tr><tr><td colspan="4"> חם הפתרון 37 ° C כדי להמיס הג&#39;לטין מספיק. אמנם עדיין חמים, לסנן לתוך בקבוקים סטריליים autoclaved ולאחסן ב 4 ° C </td></tr></tbody></table>

study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing gfp-actin

האנדותל כלי הדם ממלא תפקיד חשוב כמחסום סלקטיבי חדיר נוזלים מומסים. צמתים דבק בין לתאי אנדותל להסדיר החדירות של האנדותל, ומחקרים רבים הראו את תרומתו החשובה של cytoskeleton אקטין לקביעת שלמות junctional 1-5. חגורת אקטין קורטיקלי נחשב חשוב לשמירה על יציבות צמתים 1, 2, 4, 5. לעומת זאת, סיבי אקטין מתח נחשבים ליצור מתיחות בתוך צנטריפטלי ותאי האנדותל כי מחלישה צמתים 2-5. הרבה תיאוריה זו התבססה על מחקרים שבהם לתאי אנדותל מטופלים עם מתווכים דלקתיים ידוע להגדיל חדירות האנדותל, ולאחר מכן תיקנה את התאים תיוג F-אקטין להסתכלות מיקרוסקופית. עם זאת, מחקרים אלו מספקים הבנה מוגבלת מאוד של תפקיד cytoskeleton אקטין כי תמונות של תאים קבוע לספק תמונות בלבדזמן ללא מידע על הדינמיקה של מבנים אקטין 5. Live-תא הדמיה מאפשר שילוב של האופי הדינמי של cytoskeleton אקטין לתוך המחקרים של מנגנוני קביעת שלמות מחסום אנדותל. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא כי ההשפעה של גירויים דלקתיים שונים על מבנים אקטין בתאי אנדותל ניתן להעריך אותה קבוצה של תאים חיים לפני ואחרי טיפול, הסרת הטיה פוטנציאלית שעלולה להתרחש בעת התבוננות דגימות קבועות. האדם וריד הטבור לתאי אנדותל (HUVEC) הם transfected עם אקטין GFP-β פלסמיד וגדל מפגש על coverslips זכוכית. זמן לשגות תמונות של ה-GFP-אקטין ב HUVEC ומחוברות נלכדים לפני ואחרי תוספת של מתווכים דלקתיים כי לעורר תלוי זמן שינויים שלמות מחסום אנדותל. מחקרים אלה מאפשרים תצפית ויזואלית של רצף נוזל שינויים cytoskeleton אקטין שתורמים endotheliaאני שיבוש מחסום ושיקום. התוצאות שלנו מראים בעקביות המקומי, אקטין עשיר היווצרות lamellipodia מחזור בתאי אנדותל. התהוות ותנועה של סיבי אקטין הלחץ יכול להיות גם ציין. ניתוח תדירות היווצרות מחזור של lamellipodia המקומית, לפני ואחרי הטיפול עם גירוי דלקתי יכול להיות מתועד על ידי מנתח רשם גלים. מחקרים אלו מספקים מידע חשוב על אופייה הדינאמי של cytoskeleton אקטין בתאי אנדותל שניתן להשתמש כדי לגלות המנגנונים המולקולריים מזוהה קודם לכן חשוב לשמירה על שלמות המחסום אנדותל.

Watch this Scientific Journal Video about Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin at JoVE.com

Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

הדמיה מיקרוסקופית של תאים אנדותל לחיות להביע GFP-אקטין מאפשר אפיון של שינויים דינמיים מבנים cytoskeletal. שלא כמו טכניקות להשתמש דגימות קבוע, שיטה זו מספקת הערכה מפורטת של השינויים הזמני cytoskeleton אקטין בתאי אותו לפני, במהלך ואחרי גירויים פיזיים, תרופתי, או דלקתיים שונים.

עיון cytoskeleton אקטין ב לתאי אנדותל חיים הבעת GFP-אקטין

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

The Cytoskeleton I: Actin and Microfilaments

SCIENTISTS IN ACTION

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

בדיקת רגישות חזותית על מהירות ועל כיוון התנועה של לטאות

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

מחשב שנוצר מודל החיה גירויים

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

אקטין Co-Assay שקיעה, כי ניתוח של חלבון מחייב את ה-F-אקטין

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

דימות של תא חי F-אקטין Dynamics באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית רבב (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

הדמיה חיה של תנועתיות התא ואת cytoskeleton אקטין של נוירונים בודדים לבין תאים קרסט עצבית בעוברים דג הזברה

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

עשה זאת בעצמך התקן להבראת דוגמאות Cryopreserved בטעות ירד לתוך טנקים אחסון קריוגני

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

מיקרוסקופית Intravital למבני ההדמיה subcellular בעכברים חיים לבטא חלבוני פלורסנט

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Assay היווצרות צינור תא האנדותל ל<em&gt; במבחנה</em&gt; חקר אנגיוגנזה

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

בידוד של תאי Murine Valve האנדותל

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...