Name: study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing gfp-actin
Uploaded: 2011-11-18T13:00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin at JoVE.com

GFP - β - 굴지 플라스미드는 넉넉한 박사 웨인 오어 병리의 LSUHSC - S 부서에 의해 제공되었고, 박사 베키 Worthylake, 약리학의 LSUHSC - NO학과 실험실에서 증폭되었다. 이 작품은 국립 보건원 (P20 RR - 018766)와 미국 심장 협회 (05835386N)에서 부여에 의해 지원되었다.

<ol>
	<li>Spindler, V., Schlegel, N., Waschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+GTPases+in+control+of+microvascular+permeability.">Role of GTPases in control of microvascular permeability.</a> Cardiovasc. Res. 87, 243-253 (2010).</li><li>Wojciak-Stothard, B., Ridley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+GTPases+and+the+regulation+of+endothelial+permeability.">Rho GTPases and the regulation of endothelial permeability.</a> Vascul. Pharmacol. 39, 187-199 (2002).</li><li>Yuan, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+pathways+in+enhanced+microvascular+permeability.">Signal transduction pathways in enhanced microvascular permeability.</a> Microcirculation. 7, 395-403 (2000).</li><li>Birukov, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+GTPases+in+mechanosensitive+regulation+of+endothelial+barrier.">Small GTPases in mechanosensitive regulation of endothelial barrier.</a> Microvasc. Res. 77, 46-52 (2009).</li><li>Duran, W. N., Sanchez, F. A., Breslin, J. W., Tuma, R. F., Duran, W. N., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculatory+Exchange+Function.">Microcirculatory Exchange Function.</a> Handbook of Physiology: Microcirculation. , 81-124 (2008).</li><li>Hu, Y. L., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+motion+of+paxillin+on+actin+filaments+in+living+endothelial+cells.">Dynamic motion of paxillin on actin filaments in living endothelial cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 357, 871-876 (2007).</li><li>Borm, B., Requardt, R. P., Herzog, V., Kirfel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+ruffles+in+cell+migration:+indicators+of+inefficient+lamellipodia+adhesion+and+compartments+of+actin+filament+reorganization.">Membrane ruffles in cell migration: indicators of inefficient lamellipodia adhesion and compartments of actin filament reorganization.</a> Exp. Cell. Res. 302, 83-95 (2005).</li><li>Hotulainen, P., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+fibers+are+generated+by+two+distinct+actin+assembly+mechanisms+in+motile+cells.">Stress fibers are generated by two distinct actin assembly mechanisms in motile cells.</a> J. Cell. Biol. 173, 383-394 (2006).</li><li>Pellegrin, S., Mellor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+stress+fibres.">Actin stress fibres.</a> J. Cell. Sci. 120, 3491-3499 (2007).</li><li>Ballestrem, C., Wehrle-Haller, B., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+dynamics+in+living+mammalian+cells.">Actin dynamics in living mammalian cells.</a> J. Cell. Sci. 111, 1649-1658 (1998).</li><li>Helmke, B. P., Rosen, A. B., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+mechanical+strain+of+an+endogenous+cytoskeletal+network+in+living+endothelial+cells.">Mapping mechanical strain of an endogenous cytoskeletal network in living endothelial cells.</a> Biophys. J. 84, 2691-2699 (2003).</li><li>Birukova, A. A., Smurova, K., Birukov, K. G., Kaibuchi, K., Garcia, J. G., Verin, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Rho+GTPases+in+thrombin-induced+lung+vascular+endothelial+cells+barrier+dysfunction.">Role of Rho GTPases in thrombin-induced lung vascular endothelial cells barrier dysfunction.</a> Microvasc. Res. 67, 64-77 (2004).</li><li>van Nieuw Amerongen, G. P., van Delft, S., Vermeer, M. A., Collard, J. G., van Hinsbergh, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+RhoA+by+thrombin+in+endothelial+hyperpermeability:+role+of+Rho+kinase+and+protein+tyrosine+kinases.">Activation of RhoA by thrombin in endothelial hyperpermeability: role of Rho kinase and protein tyrosine kinases.</a> Circ. Res. 87, 335-340 (2000).</li><li>Moy, A. B., Blackwell, K., Kamath, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+histamine+and+thrombin+on+endothelial+barrier+function+through+actin-myosin+tension.">Differential effects of histamine and thrombin on endothelial barrier function through actin-myosin tension.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 282, H21-H29 (2002).</li><li>Wittman, T., Littlefield, R., Waterman-Storer, C., Goldman, R. D., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+speckle+microscopy+of+cytoskeletal+dynamics+in+living+cells.">Fluorescent speckle microscopy of cytoskeletal dynamics in living cells.</a> Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , 184-204 (2005).</li><li>Rabut, G., Ellenberg, J., Goldman, R. D., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells:+FRAP,+iFRAP,+and+FLIP.">Photobleaching techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, iFRAP, and FLIP.</a> Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , 101-126 (2005).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

라이브 내피 세포에 GFP - 굴지의 영상은 염증성 자극에 대한 응답으로 굴지의 cytoskeleton의 역학에 대한 자세한 분석을 수 있습니다. 이 방법은 또한 전단 응력 11과 같은 물리적 세력에 대응 cytoskeleton의 리모델링을 보여주는 이전 연구 결과에 기초하여 유용할 수 있습니다. 또한,이 방법은 마이 그 레이션, 유사 분열, 세포 분기점 및 junctional 성숙의 형성, 그리고 장벽 기능의 유지 보수 등 다양한 내피 세포 활동에 굴지 cytoskeletal 역학의 공헌에 대한 자세한 평가를하실 수 있습니다. 표시된 데이터의 내피 굴지의 cytoskeleton의 동작은 트롬빈 치료 전후에 볼 수 있습니다. 모든 내피 세포의 가장자리를 따라 로컬 lamellipodia은 성형과 nonconfluent과 합류 모두 세포 monolayers에 시간이 지남에 따라 regressing 관찰되었다. 트롬빈과 치료는 간단히 lamellipodia 양식을 중단ation과 매상. 트롬빈은 트롬빈이 내피 세포의 12-14 굴지 스트레스 섬유 형성 및 증가 구심 긴장 개발을 일으키는 이전 리포트와 계약에, 세포가 약간 계약에 발생했습니다. 그러나, 이와 같은 라이브 세포 이미징 연구에서 스트레스 섬유의 출처는 현재 확인할 수 있습니다. HUVEC에서 스트레스 섬유의 대부분은 세포 주변에서 발생한 및 세포 8, 9를 마이 그 레이션에 가로 아크 섬유를 닮은. 고정 세포를 사용하여 이상이 방법의 또 다른 장점은 스트레스 섬유의 수를 실험 그룹간에 선택 바이어스를 제거, 트롬빈​​ 치료 전후 각 세포에 계량 수있다는 것입니다. 이 프로토콜을 통해 우리는 셀 가장자리와 굴지의 스트레스 섬유의 역동적인 움직임을 평가합니다. photobleaching 후 내피 세포와 같은 형광 복구와 같은 고급 기술에 굴지의 모노머의 역학을 이해 (FRAP) 또는 형광는 마이크로을 작은 반점하기복사 (FSM)는 16 일 15 적용할 수 있습니다. 또한, 때문에 microvascular 내피 세포는 microvascular 장벽 기능의 더 나은 모델을 효과적으로 논리적인 미래 방향을 나타냅니다 microvascular 내피 세포에 GFP - 굴지 표현 transfection 프로토콜의 최적화를 대표하는 수도 있습니다. 요약, GFP - 굴지 표현 라이브 내피 세포의 이미징은 내피 세포 굴지의 cytoskeleton은 자극에 다양한 종류의에 응답하는 방법을 결정하는 강력한 도구를 나타냅니다. 단단히 합류 내피 monolayers를 사용하는 연구는 굴지 풍부한 lamellipodia와 내피 장벽 기능에 가로 아크 스트레스 섬유와 같은 역동적인 구조의 역할을 결정하는 데 도움이됩니다. 또한, GFP - 굴지 또는 기타 subcellular 구조의 시각화 수 있도록 다른 융합 단백질을 표현하는 내피 세포의 라이브 세포 이미징은 신호 및 구조 메커니즘을 이해하는 데 필요한 자세한 spatiotemporal 정보를 제공합니다 것이 Determine 장벽의 무결성.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> 1. 닮은 5 배 증권 </td></tr><tr><td> 화학 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 양 </td></tr><tr><td> 나트륨 염화물 </td><td> EMD </td><td> SX0420 - 3 </td><td> 35g </td></tr><tr><td> 염화칼륨 </td><td> JT 베이커 </td><td> 3040 </td><td> 1.75 g </td></tr><tr><td> 염화칼슘 </td><td> 시그마 </td><td> C - 3881 </td><td> 1.47 g </td></tr><tr><td> 마그네슘 황산 </td><td> 시그마 </td><td> M - 9397 </td><td> 1.44 g </td></tr><tr><td> 무균 필터링 물 </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 1 L에 지참 </td></tr><tr><td colspan="4"> 4 autoclaved 병 및 상점으로 살균 필터 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 2. 맙스 버퍼 </td></tr><tr><td> 화학 </td><td>회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 양 </td></tr><tr><td> 맙스 </td><td> 시그마 </td><td> M3183 </td><td> 125.6 g </td></tr><tr><td> 무균 필터링 물 </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 1 L에 지참 </td></tr><tr><td colspan="4"> 4 autoclaved 병 및 상점으로 살균 필터 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 3. 알부민 생리 식염수 (APSS) </td></tr><tr><td> 화학 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 양 </td></tr><tr><td> 닮은 주식 (5 배) </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 200 ML </td></tr><tr><td> 맙스 버퍼 </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 5 ML </td></tr><tr><td> 인산 나트륨 </td><td> 시그마 </td><td> S - 9638 </td><td> 0.168 g </td></tr><tr><td> 나트륨 Pyruvate &lt;/ TD&gt; <td> 시그마 </td><td> P5280 </td><td> 0.22 g </td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 나트륨 소금 </td><td> 시그마 </td><td> ED2SS </td><td> 0.0074 g </td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> 시그마 </td><td> G7528 </td><td> 0.901 g </td></tr><tr><td> 알부민, 소의 </td><td> USB </td><td> 10,856 </td><td> 10g </td></tr><tr><td> 무균 필터링 물 </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 1 L에 지참 </td></tr><tr><td colspan="4"> 37 7.4로 산도를 조절 ° C, 4 autoclaved 병 및 저장에 다음 살균 필터 ° C. </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 4. 0.9 %의 염분 </td></tr><tr><td> 화학 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 양 </td></tr><tr><td> 나트륨 염화물 </td><td> EMD </td><td> SX0420 - 3 </td><td> 9g </td></tr><tr><td> 무균 필터링 물 </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 1 L에 지참 </td></tr><tr><td colspan="4"> 4 autoclaved 병 및 상점으로 살균 필터 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 5. 1.5 % 다행 솔루션 </td></tr><tr><td> 돼지의 피부에서 젤라틴 </td><td> 시그마 </td><td> G2500 </td><td> 15g </td></tr><tr><td> 0.9 %의 염분 </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 1 L에 지참 </td></tr><tr><td colspan="4"> 37에 대한 해결책을 따뜻하게 ° C 충분히 젤라틴 디졸브 수 있습니다. 동안 4 autoclaved 병 및 저장에 여전히 따뜻하고, 살균 필터 ° C </td></tr></tbody></table>

study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing gfp-actin

microvascular 내피는 유체와 solutes에 선택적으로 투과 장벽으로 중요한 역할을합니다. 내피 세포 사이의 접착제 분기점은 내피의 투과성을 조절하고, 많은 연구가 junctional 무결성 1-5 결정하기 위해 굴지의 cytoskeleton의 중요한 기여를 표명했습니다. 피질 굴지 벨트는 안정적인 분기점 1, 2, 4, 5의 유지에 중요한 것으로 생각됩니다. 반대로, 굴지의 스트레스 섬유 분기점 2-5 약화 내피 세포 내에서 구심력 장력을 생성하는 생각입니다. 대부분이 이론은 내피 세포가 내피 투과성을 증가하는 것으로 알려져 염증 중재자로 치료 후 세포를 고정하고 현미경 관찰을위한 F - 굴지 분류하는 연구를 기반으로하고 있습니다. 에서 수정된 세포의 이미지만을 스냅샷을 제공하기 때문에 그러나 이러한 연구는 굴지의 cytoskeleton의 역할이 매우 제한된 이해를 제공합니다굴지의 구조 5 역학에 대한 정보와 시간. 라이브 세포 이미징은 내피 장벽 무결성을 결정하는 메커니즘의 연구에 굴지의 cytoskeleton의 동적 특성의 결합을 허용합니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 내피 세포에서 굴지의 구조에 대한 다양한 염증성 자극의 영향이 고정 표본을 관찰하는 경우에 발생할 수있는 잠재적인 편견을 제거하기 전에 살아있는 세포의 동일한 세트에서 치료 후 평가 될 수있다는 것이다. 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)는 플라스미드 GFP - β - 굴지로 transfected 유리 coverslips에 합류하기 위해 성장하고 있습니다. 합류 HUVEC에서 GFP - 굴지의 시간 저속 이미지는 내피 장벽 무결성 시간 종속적인 변화를 이끌어내는 염증 중재자의 추가 전후 캡처됩니다. 이러한 연구는 endothelia에 기여하는 굴지의 cytoskeleton의 변화 유체 순서의 시각적 관찰을 활성화내 장벽 파괴 및 복원. 우리의 결과는 지속적으로 내피 세포의 지방, 굴지 풍부한 lamellipodia 형성과 매출을 보여줍니다. 굴지의 스트레스 섬유의 형성과 움직임도 볼 수 있습니다. 염증성 자극 치료 전후 지역 lamellipodia의 형성과 매상의 주파수 분석은 kymograph 분석하여 문서화 수 있습니다. 이러한 연구는 내피 장벽의 무결성의 유지를위한 중요한 이전에 정체 불명의 분자 메커니즘을 발견하는 데 사용할 수있는 내피 세포에있는 굴지의 cytoskeleton의 동적 특성에 대한 중요한 정보를 제공합니다.

Watch this Scientific Journal Video about Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin at JoVE.com

Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

GFP - 굴지 표현 라이브 내피 세포의 미세 영상은 cytoskeletal 구조에서 동적 변화 특성화 수 있습니다. 고정 표본을 사용하는 기술과는 달리,이 방법은 전에 동일한 세포에있는 굴지의 cytoskeleton의 시간적 변화에 대한 자세한 평가, 동안 다양한 물리적, 약리, 또는 염증성 자극 후를 제공합니다.

GFP - 굴지 표현 라이브 내피 세포 굴지의 Cytoskeleton 연구

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

The Cytoskeleton I: Actin and Microfilaments

SCIENTISTS IN ACTION

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

도마뱀의 운동의 속도와 방향에 시각 민감도 테스트

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

연구

생물학

Computer-Generated Animal Model Stimuli

컴퓨터가 만든 동물 모델 자극

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

굴지 공동 침강 분석, F - 굴지에 바인딩 단백질의 분석

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

형광등을 통해 F - 굴지 역학 라이브 셀 이미징은 현미경을 스페클 (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

세포 운동성 및 Zebrafish 태아의 개별 뉴런과 신경 크레스트 세포의 굴지의 Cytoskeleton의 라이브 영상

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Cryopreserved 샘플 복구를 위해 손수 함 장치 실수로 극저온 저장 탱크 떨어졌고

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

사멸 세포 간극의 이미지를하는 동안 라이브<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

형광 단백질을 표현 라이브 마우스의 이미징 세포 이하의 구조물의 intravital 현미경

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

에 대한 내피 세포의 관 형성의 분석<em&gt; 체외</em&gt; 혈관 신생 연구

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

쥐과 밸브 내피 세포의 분리

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...