Name: study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing gfp-actin
Uploaded: 2011-11-18T13:00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin at JoVE.com

Den GFP-β-actin plasmid ble generøst gitt av Dr. Wayne Orr, LSUHSC-S Avdeling for patologi, og ble forsterket i laboratoriet av Dr. Becky Worthylake, LSUHSC-NO Institutt for farmakologi. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Institutes of Health (P20 RR-018766) og American Heart Association (05835386N).

<ol>
	<li>Spindler, V., Schlegel, N., Waschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+GTPases+in+control+of+microvascular+permeability.">Role of GTPases in control of microvascular permeability.</a> Cardiovasc. Res. 87, 243-253 (2010).</li><li>Wojciak-Stothard, B., Ridley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+GTPases+and+the+regulation+of+endothelial+permeability.">Rho GTPases and the regulation of endothelial permeability.</a> Vascul. Pharmacol. 39, 187-199 (2002).</li><li>Yuan, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+pathways+in+enhanced+microvascular+permeability.">Signal transduction pathways in enhanced microvascular permeability.</a> Microcirculation. 7, 395-403 (2000).</li><li>Birukov, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+GTPases+in+mechanosensitive+regulation+of+endothelial+barrier.">Small GTPases in mechanosensitive regulation of endothelial barrier.</a> Microvasc. Res. 77, 46-52 (2009).</li><li>Duran, W. N., Sanchez, F. A., Breslin, J. W., Tuma, R. F., Duran, W. N., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculatory+Exchange+Function.">Microcirculatory Exchange Function.</a> Handbook of Physiology: Microcirculation. , 81-124 (2008).</li><li>Hu, Y. L., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+motion+of+paxillin+on+actin+filaments+in+living+endothelial+cells.">Dynamic motion of paxillin on actin filaments in living endothelial cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 357, 871-876 (2007).</li><li>Borm, B., Requardt, R. P., Herzog, V., Kirfel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+ruffles+in+cell+migration:+indicators+of+inefficient+lamellipodia+adhesion+and+compartments+of+actin+filament+reorganization.">Membrane ruffles in cell migration: indicators of inefficient lamellipodia adhesion and compartments of actin filament reorganization.</a> Exp. Cell. Res. 302, 83-95 (2005).</li><li>Hotulainen, P., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+fibers+are+generated+by+two+distinct+actin+assembly+mechanisms+in+motile+cells.">Stress fibers are generated by two distinct actin assembly mechanisms in motile cells.</a> J. Cell. Biol. 173, 383-394 (2006).</li><li>Pellegrin, S., Mellor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+stress+fibres.">Actin stress fibres.</a> J. Cell. Sci. 120, 3491-3499 (2007).</li><li>Ballestrem, C., Wehrle-Haller, B., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+dynamics+in+living+mammalian+cells.">Actin dynamics in living mammalian cells.</a> J. Cell. Sci. 111, 1649-1658 (1998).</li><li>Helmke, B. P., Rosen, A. B., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+mechanical+strain+of+an+endogenous+cytoskeletal+network+in+living+endothelial+cells.">Mapping mechanical strain of an endogenous cytoskeletal network in living endothelial cells.</a> Biophys. J. 84, 2691-2699 (2003).</li><li>Birukova, A. A., Smurova, K., Birukov, K. G., Kaibuchi, K., Garcia, J. G., Verin, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Rho+GTPases+in+thrombin-induced+lung+vascular+endothelial+cells+barrier+dysfunction.">Role of Rho GTPases in thrombin-induced lung vascular endothelial cells barrier dysfunction.</a> Microvasc. Res. 67, 64-77 (2004).</li><li>van Nieuw Amerongen, G. P., van Delft, S., Vermeer, M. A., Collard, J. G., van Hinsbergh, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+RhoA+by+thrombin+in+endothelial+hyperpermeability:+role+of+Rho+kinase+and+protein+tyrosine+kinases.">Activation of RhoA by thrombin in endothelial hyperpermeability: role of Rho kinase and protein tyrosine kinases.</a> Circ. Res. 87, 335-340 (2000).</li><li>Moy, A. B., Blackwell, K., Kamath, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+histamine+and+thrombin+on+endothelial+barrier+function+through+actin-myosin+tension.">Differential effects of histamine and thrombin on endothelial barrier function through actin-myosin tension.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 282, H21-H29 (2002).</li><li>Wittman, T., Littlefield, R., Waterman-Storer, C., Goldman, R. D., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+speckle+microscopy+of+cytoskeletal+dynamics+in+living+cells.">Fluorescent speckle microscopy of cytoskeletal dynamics in living cells.</a> Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , 184-204 (2005).</li><li>Rabut, G., Ellenberg, J., Goldman, R. D., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells:+FRAP,+iFRAP,+and+FLIP.">Photobleaching techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, iFRAP, and FLIP.</a> Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , 101-126 (2005).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklært.

Den avbildning av GFP-aktin i live endotelceller muliggjør en detaljert analyse av dynamikken i aktin cytoskjelettet i respons til inflammatoriske stimuli. Denne metoden kan også være nyttig å bygge videre på tidligere funn som viser ombygging av cytoskjelettet i respons på fysiske krefter som skjærspenning 11. I tillegg gir denne metoden en detaljert vurdering av bidraget fra aktin cytoskeletal dynamikk til ulike endotelcelle aktiviteter, blant annet migrasjon, mitose, dannelse av intercellulær veikryss og junctional modning, og vedlikehold av barrierefunksjon. I data vises, kan atferden til endotelial aktin cytoskjelettet observeres før og etter behandling med trombin. Lokale lamellipodia langs kantene av endotelceller ble observert forming og tilbakegang over tid i både nonconfluent og confluent celle monolayers. Behandling med trombin kort avbrutt lamellipodia skjemaasjon og omsetning. Trombin også forårsaket cellene til kontrakt litt, i enighet med tidligere rapporter som trombin forårsaker actin stresset fiber dannelse og økt sentripetal spenning utvikling i endotelceller 12-14. Men fra levende celle imaging studier som dette, kan opprinnelsen til stress fiber nå bestemmes. I HUVEC, de fleste av stress fibrene kommer på cellen periferien og ligner tverrgående arc fibre i migrere celler 8, 9. En annen styrke med denne metoden enn ved hjelp av faste celler er at antallet av stress fibre kan kvantifiseres i individuelle celler før og etter trombin behandling, eliminerer utvalg skjevhet mellom eksperimentelle grupper. Med denne protokollen evaluerer vi dynamisk bevegelse av cellen kanten og aktin stresset fiber. For å forstå aktin monomer dynamikk i endotelceller, mer avanserte teknikker som fluorescens recovery etter fotobleking (FRAP) eller fluorescens speckle MICROSkopi (FSM) kan brukes 15, 16. I tillegg, fordi mikrovaskulære endotelceller kan representere en bedre modell av mikrovaskulær barrierefunksjon, optimalisering av transfeksjon protokoller for effektivt å uttrykke GFP-aktin i mikrovaskulære endotelceller representerer en logisk fremtidige retning. I sammendraget, representerer avbildning av levende endotelceller uttrykker GFP-aktin et kraftig verktøy for å bestemme hvordan endotelcelle aktin cytoskjelettet reagerer på ulike typer stimuli. Studier med tett confluent endotelial monolayers vil bidra til å bestemme rollene av dynamiske strukturer som aktin-rik lamellipodia og tverrgående arc stresset fiber i endotelial barrierefunksjon. I tillegg vil leve celle avbildning av endotelceller uttrykker GFP-aktin eller andre fusjon proteiner som tillater visualisering av andre subcellular strukturer gi detaljert i tid og rom nødvendig informasjon for å forstå signalering og strukturelle mekanismer som determine barriere integritet.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> 1. Ringer 5x Stock </td></tr><tr><td> Kjemisk </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Beløp </td></tr><tr><td> Natriumklorid </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 35 g </td></tr><tr><td> Kaliumklorid </td><td> JT Baker </td><td> 3040 </td><td> 1,75 g </td></tr><tr><td> Kalsiumklorid </td><td> Sigma </td><td> C-3881 </td><td> 1,47 g </td></tr><tr><td> Magnesium Sulfate </td><td> Sigma </td><td> M-9397 </td><td> 1,44 g </td></tr><tr><td> Sterile Filtrert Vann </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Bring til 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Sterile filteret inn autoklaveres flasker og lagrer ved 4 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 2. Mopper buffer </td></tr><tr><td> Kjemisk </td><td>Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Beløp </td></tr><tr><td> Mopper </td><td> Sigma </td><td> M3183 </td><td> 125,6 g </td></tr><tr><td> Sterile Filtrert Vann </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Bring til 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Sterile filteret inn autoklaveres flasker og lagrer ved 4 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 3. Albumin Fysiologiske Salt Solution (APSS) </td></tr><tr><td> Kjemisk </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Beløp </td></tr><tr><td> Ringer lager (5x) </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> Mopper Buffer </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 5 mL </td></tr><tr><td> Natriumfosfat </td><td> Sigma </td><td> S-9638 </td><td> 0,168 g </td></tr><tr><td> Sodium Pyruvat &lt;/ Td&gt; <td> Sigma </td><td> P5280 </td><td> 0,22 g </td></tr><tr><td> EDTA natrium salt </td><td> Sigma </td><td> ED2SS </td><td> 0.0074 g </td></tr><tr><td> Glukose </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td> 0,901 g </td></tr><tr><td> Albumin, Bovine </td><td> USB </td><td> 10856 </td><td> 10 g </td></tr><tr><td> Sterile Filtrert Vann </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Bring til 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Juster pH til 7,4 ved 37 ° C, deretter sterile filteret inn autoklaveres flasker og oppbevar ved 4 ° C. </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> Fire. 0,9% Saline </td></tr><tr><td> Kjemisk </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Beløp </td></tr><tr><td> Natriumklorid </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 9 g </td></tr><tr><td> Sterile Filtrert Vann </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Bring til 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Sterile filteret inn autoklaveres flasker og lagrer ved 4 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 5. 1,5% Gelatin Solution </td></tr><tr><td> Gelatin fra svin hud </td><td> Sigma </td><td> G2500 </td><td> 15 g </td></tr><tr><td> 0,9% Saline </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Bring til 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Varm løsningen til 37 ° C for å løse opp gelatin tilstrekkelig. Mens han fortsatt varm, sterile filteret inn autoklaveres flasker og oppbevar ved 4 ° C </td></tr></tbody></table>

study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing gfp-actin

Den mikrovaskulær endotelet spiller en viktig rolle som et selektivt permeabel barriere mot væske og oppløste stoffer. Limet veikryss mellom endotelcellene regulere permeabilitet av endotelet, og mange studier har indikert det viktige bidraget av aktin cytoskjelettet å bestemme junctional integritet 1-5. En kortikale aktin belte antas å være viktig for å opprettholde stabile 1 veikryss, 2, 4, 5. I kontrast er aktin stresset fiber antatt å generere sentripetal spenning i endotelceller som svekker veikryss 2-5. Mye av denne teorien har vært basert på studier der endotelcellene er behandlet med inflammatoriske mediatorer kjent for å øke endotelceller permeabilitet, og deretter fikse cellene og merking av F-aktin for mikroskopisk observasjon. Men disse studiene gir en svært begrenset forståelse av rollen av aktin cytoskjelettet fordi bilder av faste celler gir bare øyeblikksbilder itid med ingen informasjon om dynamikken i aktin strukturer 5. Live-cell imaging muliggjør inkorporering av den dynamiske naturen av aktin cytoskjelettet inn i studier av de mekanismer avgjøre endoteliale barriere integritet. En stor fordel med denne metoden er at virkningen av ulike inflammatoriske stimuli på actin strukturer i endotelceller kan vurderes på samme sett av levende celler før og etter behandling, fjerne potensielle skjevheter som kan oppstå når observere faste prøver. Menneskelig umbilical vein endotelceller (HUVEC) er transfektert med GFP-β-aktin plasmid og vokst til sammenløpet på glass Dekkglass. Time-lapse bilder av GFP-aktin i confluent HUVEC blir fanget før og etter tilsetning av inflammatoriske mediatorer som framprovosere tidsavhengige forandringer i endoteliale barriere integritet. Disse studiene gir visuell observasjon av væske sekvensen av endringer i aktin cytoskjelettet som bidrar til endothelial barriere avbrudd og restaurering. Våre resultater viser gjennomgående lokale, actin-rik lamellipodia dannelse og omsetning i endotelceller. Dannelse og bevegelse av aktin stresset fiber kan også observeres. En analyse av hyppigheten av dannelse og omsetning av de lokale lamellipodia, før og etter behandling med inflammatoriske stimuli kan dokumenteres ved kymograph analyser. Disse studiene gir viktig informasjon om dynamiske natur aktin cytoskjelettet i endotelceller som kan brukes til å oppdage tidligere uidentifiserte molekylære mekanismer viktig for opprettholdelse av endoteliale barriere integritet.

Watch this Scientific Journal Video about Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin at JoVE.com

Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

Mikroskopiske avbildning av levende endotelceller uttrykker GFP-aktin lar karakterisering av dynamiske endringer i cytoskeletal strukturer. I motsetning til teknikker som bruker faste prøver, gir denne metoden en detaljert vurdering av tidsmessige endringer i aktin cytoskjelettet i de samme cellene før, under og etter ulike fysiske, farmakologiske, eller provoserende stimuli.

Studie av aktin cytoskjelettet i Live endotelceller uttrykker GFP-Actin

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

The Cytoskeleton I: Actin and Microfilaments

SCIENTISTS IN ACTION

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Gjør-det-selv Enhet for gjenoppretting av Cryopreserved Prøver uhell falt inn Kryogeniske lagertanker

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Leve Imaging av apoptotiske Cell Lagersalg under<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Intramikros for Imaging subcellulære strukturer i levende mus Uttrykke Fluorescent Proteiner

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Endothelial Cell Tube Dannelse Assay for<em&gt; In Vitro</em&gt; Study of Angiogenese

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolering av Murint Valve endotelceller

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...