Name: study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing gfp-actin
Uploaded: 2011-11-18T13:00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin at JoVE.com

GFP-β-актина плазмида была любезно предоставлена ​​д-р Уэйн Орр, LSUHSC-S отдел патологии, и усиливалось в лаборатории доктора Бекки Worthylake, LSUHSC-NO кафедрой фармакологии. Эта работа была поддержана грантами от Национального института здоровья (P20 RR-018766) и Американской ассоциации сердца (05835386N).

<ol>
	<li>Spindler, V., Schlegel, N., Waschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+GTPases+in+control+of+microvascular+permeability.">Role of GTPases in control of microvascular permeability.</a> Cardiovasc. Res. 87, 243-253 (2010).</li><li>Wojciak-Stothard, B., Ridley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+GTPases+and+the+regulation+of+endothelial+permeability.">Rho GTPases and the regulation of endothelial permeability.</a> Vascul. Pharmacol. 39, 187-199 (2002).</li><li>Yuan, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+pathways+in+enhanced+microvascular+permeability.">Signal transduction pathways in enhanced microvascular permeability.</a> Microcirculation. 7, 395-403 (2000).</li><li>Birukov, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+GTPases+in+mechanosensitive+regulation+of+endothelial+barrier.">Small GTPases in mechanosensitive regulation of endothelial barrier.</a> Microvasc. Res. 77, 46-52 (2009).</li><li>Duran, W. N., Sanchez, F. A., Breslin, J. W., Tuma, R. F., Duran, W. N., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculatory+Exchange+Function.">Microcirculatory Exchange Function.</a> Handbook of Physiology: Microcirculation. , 81-124 (2008).</li><li>Hu, Y. L., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+motion+of+paxillin+on+actin+filaments+in+living+endothelial+cells.">Dynamic motion of paxillin on actin filaments in living endothelial cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 357, 871-876 (2007).</li><li>Borm, B., Requardt, R. P., Herzog, V., Kirfel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+ruffles+in+cell+migration:+indicators+of+inefficient+lamellipodia+adhesion+and+compartments+of+actin+filament+reorganization.">Membrane ruffles in cell migration: indicators of inefficient lamellipodia adhesion and compartments of actin filament reorganization.</a> Exp. Cell. Res. 302, 83-95 (2005).</li><li>Hotulainen, P., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+fibers+are+generated+by+two+distinct+actin+assembly+mechanisms+in+motile+cells.">Stress fibers are generated by two distinct actin assembly mechanisms in motile cells.</a> J. Cell. Biol. 173, 383-394 (2006).</li><li>Pellegrin, S., Mellor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+stress+fibres.">Actin stress fibres.</a> J. Cell. Sci. 120, 3491-3499 (2007).</li><li>Ballestrem, C., Wehrle-Haller, B., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+dynamics+in+living+mammalian+cells.">Actin dynamics in living mammalian cells.</a> J. Cell. Sci. 111, 1649-1658 (1998).</li><li>Helmke, B. P., Rosen, A. B., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+mechanical+strain+of+an+endogenous+cytoskeletal+network+in+living+endothelial+cells.">Mapping mechanical strain of an endogenous cytoskeletal network in living endothelial cells.</a> Biophys. J. 84, 2691-2699 (2003).</li><li>Birukova, A. A., Smurova, K., Birukov, K. G., Kaibuchi, K., Garcia, J. G., Verin, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Rho+GTPases+in+thrombin-induced+lung+vascular+endothelial+cells+barrier+dysfunction.">Role of Rho GTPases in thrombin-induced lung vascular endothelial cells barrier dysfunction.</a> Microvasc. Res. 67, 64-77 (2004).</li><li>van Nieuw Amerongen, G. P., van Delft, S., Vermeer, M. A., Collard, J. G., van Hinsbergh, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+RhoA+by+thrombin+in+endothelial+hyperpermeability:+role+of+Rho+kinase+and+protein+tyrosine+kinases.">Activation of RhoA by thrombin in endothelial hyperpermeability: role of Rho kinase and protein tyrosine kinases.</a> Circ. Res. 87, 335-340 (2000).</li><li>Moy, A. B., Blackwell, K., Kamath, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+histamine+and+thrombin+on+endothelial+barrier+function+through+actin-myosin+tension.">Differential effects of histamine and thrombin on endothelial barrier function through actin-myosin tension.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 282, H21-H29 (2002).</li><li>Wittman, T., Littlefield, R., Waterman-Storer, C., Goldman, R. D., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+speckle+microscopy+of+cytoskeletal+dynamics+in+living+cells.">Fluorescent speckle microscopy of cytoskeletal dynamics in living cells.</a> Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , 184-204 (2005).</li><li>Rabut, G., Ellenberg, J., Goldman, R. D., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells:+FRAP,+iFRAP,+and+FLIP.">Photobleaching techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, iFRAP, and FLIP.</a> Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , 101-126 (2005).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Визуализации GFP-актин в живых клетках эндотелия позволяет детальный анализ динамики актина цитоскелета в ответ на воспалительные стимулы. Этот метод может быть также полезно опираться на предыдущие результаты исследования, реконструкции цитоскелета в ответ на физические силы, как напряжение сдвига 11. Кроме того, этот метод позволяет детальной оценки вклада актина цитоскелета динамику различных эндотелиальных деятельность клеток, включая миграцию, митоз, формирование межклеточных соединений и соединительных созревания, и поддержание барьерной функции. В данных показал, поведение эндотелия цитоскелета актина можно наблюдать до и после лечения с помощью тромбина. Местные lamellipodia все по краям эндотелиальных клеток наблюдалось формирование и регресс в течение долгого времени в обоих nonconfluent и сливной монослоя клеток. Лечение тромбина ненадолго прерваться lamellipodia формуation и оборота. Тромбин также вызывает клетки сокращаться немного, в согласии с предыдущими докладами, что тромбин причины стресса актина формирование волокна и увеличение центростремительного развития напряженности в эндотелиальных клетках 12-14. Тем не менее, от живой клетки изображений исследования, такие, как эта, происхождение стресс волокна может быть определена. В HUVEC, большинство из стресса волокнах возникают на периферии клетки и напоминают волокна поперечной дуги в мигрирующих клетках 8, 9. Другой сильной стороной этого метода по сравнению с использованием фиксированных клеток, что количество стресса волокна могут быть определены количественно в отдельных клетках до и после лечения тромбина, устраняя ошибки отбора экспериментальных групп. С помощью этого протокола мы оцениваем динамическое движение краю клетки и волокна актина стресса. Для того чтобы понять динамику актиновых мономеров в эндотелиальных клетках, более продвинутые методы, такие как флуоресценция восстановления после фотообесцвечивания (FRAP) или флуоресценции спекл-микроскопиикопия (ФШМ) может быть применена 15, 16. Кроме того, из клеток эндотелия капилляров может представлять лучшие модели микрососудистых барьерной функции, оптимизация трансфекции протоколов эффективно выразить GFP-актина в клетках эндотелия капилляров представляет логическое направление будущего. Таким образом, изображение живых эндотелиальных клеток, экспрессирующих GFP-актин представляет собой мощный инструмент, чтобы определить, как эндотелиальные цитоскелета актина клетка реагирует на различные виды раздражителей. Исследования с использованием плотно сливной эндотелиальных монослоев поможет определить роль динамических структур, таких как актин-богатых lamellipodia и поперечные дуги напряжение волокон в функции эндотелия барьер. Кроме того, живые изображения ячейке эндотелиальных клеток, экспрессирующих GFP-актин или других белков слияния, которые позволяют визуализировать других субклеточных структур будет представить подробную пространственно-временной информации, необходимой для понимания сигнализации и структурные механизмы, которые гetermine барьер целостности.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> 1. Рингер 5x со </td></tr><tr><td> Химический </td><td> Компания </td><td> Номер в каталоге </td><td> Количество </td></tr><tr><td> Хлористый натрий </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 35 г </td></tr><tr><td> Хлористый калий </td><td> JT Baker </td><td> 3040 </td><td> 1,75 г </td></tr><tr><td> Хлорид кальция </td><td> Сигма </td><td> C-3881 </td><td> 1,47 г </td></tr><tr><td> Сульфат магния </td><td> Сигма </td><td> М-9397 </td><td> 1,44 г </td></tr><tr><td> Стерильные фильтрованной воды </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Довести до 1 л </td></tr><tr><td colspan="4"> Стерильные фильтр в автоклаве бутылки и сохраняет при температуре 4 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 2. MOPS буфера </td></tr><tr><td> Химический </td><td>Компания </td><td> Номер в каталоге </td><td> Количество </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> Сигма </td><td> M3183 </td><td> 125,6 г </td></tr><tr><td> Стерильные фильтрованной воды </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Довести до 1 л </td></tr><tr><td colspan="4"> Стерильные фильтр в автоклаве бутылки и сохраняет при температуре 4 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 3. Альбумин физиологическим раствором соли (АПСС) </td></tr><tr><td> Химический </td><td> Компания </td><td> Номер в каталоге </td><td> Количество </td></tr><tr><td> Рингер акций (5x) </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 200 мл </td></tr><tr><td> Швабры буфера </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 5 мл </td></tr><tr><td> Фосфат натрия </td><td> Сигма </td><td> S-9638 </td><td> 0,168 г </td></tr><tr><td> Натрий Пируват &lt;/ TD&gt; <td> Сигма </td><td> P5280 </td><td> 0,22 г </td></tr><tr><td> Натриевая соль ЭДТА </td><td> Сигма </td><td> ED2SS </td><td> 0,0074 г </td></tr><tr><td> Глюкоза </td><td> Сигма </td><td> G7528 </td><td> 0,901 г </td></tr><tr><td> Альбумин, говядину </td><td> USB </td><td> 10856 </td><td> 10 г </td></tr><tr><td> Стерильные фильтрованной воды </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Довести до 1 л </td></tr><tr><td colspan="4"> Отрегулируйте рН до 7,4 при 37 ° С, то стерильный фильтр в автоклаве бутылки и хранить при 4 ° C. </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 4. 0,9% Соленая </td></tr><tr><td> Химический </td><td> Компания </td><td> Номер в каталоге </td><td> Количество </td></tr><tr><td> Хлористый натрий </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 9 г </td></tr><tr><td> Стерильные фильтрованной воды </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Довести до 1 л </td></tr><tr><td colspan="4"> Стерильные фильтр в автоклаве бутылки и сохраняет при температуре 4 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 5. 1,5% раствор желатина </td></tr><tr><td> Желатин из кожи свиньи </td><td> Сигма </td><td> G2500 </td><td> 15 г </td></tr><tr><td> 0,9% Соленая </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Довести до 1 л </td></tr><tr><td colspan="4"> Теплый раствор до 37 ° С для растворения желатина в достаточной степени. Еще теплый, стерильный фильтр в автоклаве бутылки и хранить при 4 ° C </td></tr></tbody></table>

study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing gfp-actin

Микрососудистых эндотелий играет важную роль в качестве выборочно проницаемой барьер для жидкостей и растворенных веществ. Клей соединения между эндотелиальных клеток регулируют проницаемость эндотелия, и многие исследования показали, важный вклад актина цитоскелета определения целостности соединительных 1-5. Корковых пояса актина считается важным для поддержания стабильного переходы 1, 2, 4, 5. В противоположность этому, волокна актина стресс, как полагают, генерировать центростремительные напряженности в эндотелиальных клетках, которое ослабляет контакты 2-5. Большая часть этой теории была основана на исследованиях, в которых эндотелиальные клетки обрабатывают медиаторов воспаления известно, увеличивает проницаемость эндотелия, а затем фиксация клеток и маркировка F-актин для микроскопического наблюдения. Однако, эти исследования дают весьма ограниченное представление о роли актина цитоскелета, поскольку изображения основных клетки обеспечивают только снимки ввремя нет информации о динамике структуры актина 5. Live-ячейки изображения позволяет включение динамической природы актина цитоскелета в изучении механизмов, определяющих целостность эндотелиального барьера. Основным преимуществом этого метода является то, что влияние различных воспалительных стимулов на актин структур в эндотелиальных клетках может быть оценен в тот же набор живых клеток до и после лечения, удаления потенциальных смещения, которые могут возникнуть при наблюдении фиксированных экземпляров. Пупочной вены человека эндотелиальных клеток (HUVEC) являются трансфицированных GFP-β-актина плазмиды и выросли до слияния на стекло покровные. Покадровый образы GFP-актина в сливной HUVEC фиксируются до и после того медиаторов воспаления, которые вызывают зависящие от времени изменения в эндотелиальных целостности барьера. Эти исследования позволяют визуального наблюдения жидкости последовательность изменения актина цитоскелета, которые способствуют эндотелийл нарушению барьера и реставрации. Наши результаты показывают, последовательно местных, актин богатых lamellipodia формирования и оборота в эндотелиальных клетках. Образование и движение волокон актиновых стресс может также наблюдаться. Анализ частоты формирования и оборота местного lamellipodia, до и после лечения воспалительных стимулов может быть документально подтверждено кимограф анализов. Эти исследования дают важную информацию о динамичном характере актинового цитоскелета в клетках эндотелия, который может использоваться для обнаружения ранее неизвестных молекулярных механизмов, важных для поддержания целостности эндотелиального барьера.

Watch this Scientific Journal Video about Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin at JoVE.com

Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

Микроскопические изображения живых эндотелиальных клеток, экспрессирующих GFP-актин позволяет характеристике динамических изменений цитоскелета структур. В отличие от методов, которые используют фиксированных экземпляров, этот метод обеспечивает детальную оценку временных изменений в актина цитоскелета в тех же камерах до, во время и после различных физических, фармакологических, или воспалительные стимулы.

Изучение актинового цитоскелета в клетках эндотелия Живая выражая GFP-актин

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

The Cytoskeleton I: Actin and Microfilaments

SCIENTISTS IN ACTION

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Тестирование зрительной чувствительности к скорости и направления движения в Ящерицы

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Компьютерные Стимулы животной модели

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Актина сотрудничества седиментации Пробирной; для анализа связывание белка с F-актин

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Живая изображений Сотовые Ф-актина Динамика через Флуоресцентный Спекл микроскопия (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Живая съемка подвижность клеток и актинового цитоскелета отдельных нейронов и нервных клеток Крест в данио рерио Эмбрионы

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Do-It-Yourself Устройство для восстановления криоконсервированных образцов случайно уронил в криогенных резервуаров

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Живая съемка апоптоза клеток во время акции<em&gt; Drosophila</em&gt; Эмбриогенеза

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Прижизненные микроскопия для визуализации субклеточных структур в живых мышей, экспрессирующих флуоресцентные белки

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Эндотелия Формирование Анализ сотового трубка для<em&gt; In Vitro</em&gt; Изучение ангиогенеза

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Выделение Мышиный клапана эндотелиальных клеток

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...