Name: study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing gfp-actin
Uploaded: 2011-11-18T13:00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin at JoVE.com

GFP-β-actin plasmid var generöst tillhandahålls av Dr Wayne Orr, LSUHSC-S Institutionen för patologi, och förstärktes i laboratoriet av Dr Becky Worthylake, LSUHSC-NO Institutionen för farmakologi. Detta arbete har finansierats med bidrag från National Institutes of Health (P20 RR-018.766) och American Heart Association (05835386N).

<ol>
	<li>Spindler, V., Schlegel, N., Waschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+GTPases+in+control+of+microvascular+permeability.">Role of GTPases in control of microvascular permeability.</a> Cardiovasc. Res. 87, 243-253 (2010).</li><li>Wojciak-Stothard, B., Ridley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+GTPases+and+the+regulation+of+endothelial+permeability.">Rho GTPases and the regulation of endothelial permeability.</a> Vascul. Pharmacol. 39, 187-199 (2002).</li><li>Yuan, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+pathways+in+enhanced+microvascular+permeability.">Signal transduction pathways in enhanced microvascular permeability.</a> Microcirculation. 7, 395-403 (2000).</li><li>Birukov, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+GTPases+in+mechanosensitive+regulation+of+endothelial+barrier.">Small GTPases in mechanosensitive regulation of endothelial barrier.</a> Microvasc. Res. 77, 46-52 (2009).</li><li>Duran, W. N., Sanchez, F. A., Breslin, J. W., Tuma, R. F., Duran, W. N., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculatory+Exchange+Function.">Microcirculatory Exchange Function.</a> Handbook of Physiology: Microcirculation. , 81-124 (2008).</li><li>Hu, Y. L., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+motion+of+paxillin+on+actin+filaments+in+living+endothelial+cells.">Dynamic motion of paxillin on actin filaments in living endothelial cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 357, 871-876 (2007).</li><li>Borm, B., Requardt, R. P., Herzog, V., Kirfel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+ruffles+in+cell+migration:+indicators+of+inefficient+lamellipodia+adhesion+and+compartments+of+actin+filament+reorganization.">Membrane ruffles in cell migration: indicators of inefficient lamellipodia adhesion and compartments of actin filament reorganization.</a> Exp. Cell. Res. 302, 83-95 (2005).</li><li>Hotulainen, P., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+fibers+are+generated+by+two+distinct+actin+assembly+mechanisms+in+motile+cells.">Stress fibers are generated by two distinct actin assembly mechanisms in motile cells.</a> J. Cell. Biol. 173, 383-394 (2006).</li><li>Pellegrin, S., Mellor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+stress+fibres.">Actin stress fibres.</a> J. Cell. Sci. 120, 3491-3499 (2007).</li><li>Ballestrem, C., Wehrle-Haller, B., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+dynamics+in+living+mammalian+cells.">Actin dynamics in living mammalian cells.</a> J. Cell. Sci. 111, 1649-1658 (1998).</li><li>Helmke, B. P., Rosen, A. B., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+mechanical+strain+of+an+endogenous+cytoskeletal+network+in+living+endothelial+cells.">Mapping mechanical strain of an endogenous cytoskeletal network in living endothelial cells.</a> Biophys. J. 84, 2691-2699 (2003).</li><li>Birukova, A. A., Smurova, K., Birukov, K. G., Kaibuchi, K., Garcia, J. G., Verin, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Rho+GTPases+in+thrombin-induced+lung+vascular+endothelial+cells+barrier+dysfunction.">Role of Rho GTPases in thrombin-induced lung vascular endothelial cells barrier dysfunction.</a> Microvasc. Res. 67, 64-77 (2004).</li><li>van Nieuw Amerongen, G. P., van Delft, S., Vermeer, M. A., Collard, J. G., van Hinsbergh, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+RhoA+by+thrombin+in+endothelial+hyperpermeability:+role+of+Rho+kinase+and+protein+tyrosine+kinases.">Activation of RhoA by thrombin in endothelial hyperpermeability: role of Rho kinase and protein tyrosine kinases.</a> Circ. Res. 87, 335-340 (2000).</li><li>Moy, A. B., Blackwell, K., Kamath, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+histamine+and+thrombin+on+endothelial+barrier+function+through+actin-myosin+tension.">Differential effects of histamine and thrombin on endothelial barrier function through actin-myosin tension.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 282, H21-H29 (2002).</li><li>Wittman, T., Littlefield, R., Waterman-Storer, C., Goldman, R. D., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+speckle+microscopy+of+cytoskeletal+dynamics+in+living+cells.">Fluorescent speckle microscopy of cytoskeletal dynamics in living cells.</a> Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , 184-204 (2005).</li><li>Rabut, G., Ellenberg, J., Goldman, R. D., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells:+FRAP,+iFRAP,+and+FLIP.">Photobleaching techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, iFRAP, and FLIP.</a> Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , 101-126 (2005).</li></ol>

Inga intressekonflikter deklareras.

Den avbildning av GFP-aktin i levande endotelceller möjliggör en detaljerad analys av dynamiken i aktin cytoskelettet som svar på inflammatoriska stimuli. Denna metod kan också vara bra att bygga vidare på tidigare resultat som visar ombyggnaden av cytoskelettet som svar på fysiska krafter som skjuvspänningen 11. Dessutom kan denna metod en detaljerad bedömning av bidraget från aktin cytoskelettala dynamik till olika endotelceller aktiviteter, inklusive migration, mitos, bildande av intercellulär korsningar och Junktional mognad, och underhåll av barriärfunktion. I det visade data, kan beteendet hos de endothelial aktin cytoskelettet observeras före och efter behandling med trombin. Lokala lamellipodia längs kanterna av endotelceller observerades bilda och gå bakåt med tiden i både nonconfluent och confluent cell monolager. Behandling med trombin avbryts en kort stund lamellipodia formenation och omsättning. Trombin orsakade också cellerna att ingå avtal en aning, i samförstånd med tidigare rapporter om att trombin orsakar aktin bildas stressen fiber och ökad centripetala spänning utvecklingen i endotelceller 12-14. Men från levande studier cell imaging som denna, kan ursprunget till den stress fibrer nu bestämmas. I HUVEC, de flesta av stress fibrer ursprung i cellen periferin och liknar tvärgående båge fibrer i vandrande celler 8, 9. En annan styrka med denna metod än att använda fasta celler är att antalet av stress fibrer kan kvantifieras i enskilda celler före och efter trombin behandling, vilket eliminerar selektionsfel mellan experimentella grupper. Med detta protokoll vi utvärderar dynamisk rörelse av cellen kanten och aktin fibrer stress. För att förstå aktin monomer dynamiken i endotelceller, mer avancerade tekniker såsom fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP) eller fluorescens fläckar microskopia (FSM) kan tillämpas 15, 16. Dessutom, eftersom mikrovaskulära endotelceller kan utgöra en bättre modell av mikrovaskulära barriärfunktion, optimering av transfektion protokoll för att effektivt uttrycka GFP-aktin i mikrovaskulära endotelceller representerar en logisk framtida inriktning. Sammanfattningsvis innebär avbildning av levande endotelceller uttrycker GFP-aktin ett kraftfullt verktyg för att bestämma hur endotelceller aktin cytoskelettet svarar på olika typer av stimuli. Studier med tätt konfluenta endothelial monolager kommer att avgöra vilken roll dynamiska strukturer som aktin-rika lamellipodia och tvärgående båge fibrer stress i endotelial barriärfunktion. Dessutom kommer levande cell imaging av endotelceller uttrycker GFP-aktin eller andra proteiner fusion som möjliggör visualisering av andra subcellulära strukturer ge detaljerad Spatiotemporal information som behövs för att förstå signal-och strukturella mekanismer som determine barriär integritet.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> 1. Ringer 5x Stock </td></tr><tr><td> Kemisk </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Belopp </td></tr><tr><td> Natriumklorid </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 35 g </td></tr><tr><td> Kaliumklorid </td><td> JT Baker </td><td> 3040 </td><td> 1,75 g </td></tr><tr><td> Kalciumklorid </td><td> Sigma </td><td> C-3881 </td><td> 1,47 g </td></tr><tr><td> Magnesiumsulfat </td><td> Sigma </td><td> M-9397 </td><td> 1,44 g </td></tr><tr><td> Sterila filtrerat vatten </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Ta till 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Sterila filtret i autoklaveras flaskor och butiker vid 4 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 2. MOPS buffert </td></tr><tr><td> Kemisk </td><td>Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Belopp </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> Sigma </td><td> M3183 </td><td> 125,6 g </td></tr><tr><td> Sterila filtrerat vatten </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Ta till 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Sterila filtret i autoklaveras flaskor och butiker vid 4 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 3. Albumin Fysiologisk saltlösning (APSS) </td></tr><tr><td> Kemisk </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Belopp </td></tr><tr><td> Ringer lager (5x) </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> Mops Buffer </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Natriumfosfat </td><td> Sigma </td><td> S-9638 </td><td> 0,168 g </td></tr><tr><td> Natrium Pyruvat &lt;/ Td&gt; <td> Sigma </td><td> P5280 </td><td> 0,22 g </td></tr><tr><td> EDTA natriumsalt </td><td> Sigma </td><td> ED2SS </td><td> 0,0074 g </td></tr><tr><td> Glukos </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td> 0,901 g </td></tr><tr><td> Albumin, Bovin </td><td> USB </td><td> 10.856 </td><td> 10 g </td></tr><tr><td> Sterila filtrerat vatten </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Ta till 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Justera pH till 7,4 vid 37 ° C, därefter sterila filtret i autoklaveras flaskor och förvara vid 4 ° C. </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 4. 0,9% koksaltlösning </td></tr><tr><td> Kemisk </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Belopp </td></tr><tr><td> Natriumklorid </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 9 g </td></tr><tr><td> Sterila filtrerat vatten </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Ta till 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Sterila filtret i autoklaveras flaskor och butiker vid 4 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 5. 1,5% Gelatin lösning </td></tr><tr><td> Gelatin från svin huden </td><td> Sigma </td><td> G2500 </td><td> 15 g </td></tr><tr><td> 0,9% koksaltlösning </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Ta till 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Värm lösningen till 37 ° C för att lösa upp gelatin tillräckligt. Medan fortfarande varma, sterila filtret i autoklaveras flaskor och förvara vid 4 ° C </td></tr></tbody></table>

study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing gfp-actin

Den mikrovaskulära endotel spelar en viktig roll som en selektiv permeabilitet hinder för vätskor och lösta ämnen. Limmet korsningar mellan endotelcellerna reglera genomsläpplighet av endotel, och många studier har visat det viktiga bidraget från aktin cytoskelettet att bestämma Junktional integritet 1-5. En kortikala aktin bälte tros vara viktiga för att upprätthålla stabila korsningar 1, 2, 4, 5. Däremot är aktin stressen fibrer tros generera centripetala spänningar inom endotelceller som försvagar korsningar 2-5. Mycket av denna teori har varit baserad på studier där endotelceller behandlas med inflammatoriska mediatorer kända för att öka endotelceller permeabilitet, och sedan fastställande av celler och märkning F-aktin för mikroskopisk observation. Men dessa studier ger en mycket begränsad förståelse för den roll som aktin cytoskelettet eftersom bilder av fasta celler ger endast ögonblicksbilder itid med någon information om dynamiken i aktin strukturer 5. Live-cell imaging gör införlivandet av den dynamiska karaktären hos aktin cytoskelettet i studier av de mekanismer avgöra endothelial barriären integritet. En stor fördel med denna metod är att effekten av olika inflammatoriska stimuli på aktin strukturer i endotelceller kan bedömas på samma uppsättning av levande celler före och efter behandling, ta bort eventuell bias som kan uppstå när observerar fasta prover. Mänskliga navelsträngen ven endotelceller (HUVEC) är transfererats med en GFP-β-aktin plasmid och vuxit till sammanflödet på glas täckglas. Time-lapse bilder av GFP-aktin i konfluenta HUVEC fångas före och efter tillsats av inflammatoriska mediatorer som framkallar tidsberoende förändringar i endotelceller barriär integritet. Dessa studier möjliggöra visuell kontroll av vätska sekvens av förändringar i aktin cytoskelettet som bidrar till endothelial barriär störningar och restaurering. Våra resultat visar genomgående lokal, aktin-rika lamellipodia bildning och omsättning i endotelceller. Bildandet och transport av aktin stressen fibrer kan också förekomma. En analys av frekvensen av bildning och omsättning av de lokala lamellipodia, före och efter behandling med inflammatoriska stimuli kan dokumenteras genom kymograph analyser. Dessa studier ger viktig information om den dynamiska karaktären av aktin cytoskelettet i endotelceller som kan användas för att upptäcka tidigare okända molekylära mekanismer viktiga för upprätthållandet av endotelceller barriär integritet.

Watch this Scientific Journal Video about Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin at JoVE.com

Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

Mikroskopisk avbildning av levande endotelceller uttrycker GFP-aktin gör karaktärisering av dynamiska förändringar i cytoskelettala strukturer. Till skillnad från tekniker som använder fasta prover, ger denna metod en detaljerad bedömning av temporala förändringar i aktin cytoskelettet i samma celler före, under och efter olika fysiska, farmakologiska eller inflammatoriska stimuli.

Studie av Actin cytoskelettet i Live endotelceller uttrycka GFP-Actin

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

The Cytoskeleton I: Actin and Microfilaments

SCIENTISTS IN ACTION

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testa Visual Känsligheten för hastighet och rörelseriktning i Ödlor

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Datorgenererade djurmodell Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Aktin Co-Sedimentering-analys, för analys av proteinbindning till F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Levande cell imaging av F-aktin Dynamics via Fluorescent Speckle Mikroskopi (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Bildproduktion för cell motilitet och Actin cytoskelettet av enskilda nervceller och neurala celler Crest i Zebrafish embryon

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Gör-det-själv Device för återhämtning av kryokonserverade prover Tappade misstag i Kryogena Lagringstankar

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live avbildning av Apoptotic Cell Utförsäljning under<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Intravital Mikroskopi för Imaging subcellulära strukturer i levande möss som uttrycker fluorescerande proteiner

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Endotelcell Tube Formation analys för<em&gt; In Vitro</em&gt; Studie av angiogenes

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolering av murint Ventil Endotelceller

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...