Name: isolation and culture of neural crest stem cells from human hair follicles
Uploaded: 2013-04-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles at JoVE.com

Dette arbeidet støttes av NIH stipend R01AR054593 og R01AR054593-S1 til Xu.

1. Utarbeidelse av vevskulturplater <ol><li> Coat hver brønn med nok Poly-D-lysin (PDL) til å dekke bunnen av brønnen. Tillat platene til tørk i panseret. </li><li> Etter brønnene er tørre, skyll med sterilt vann, og aspirere. Tillat platene til tørk i panseret. </li><li> Når tørr, frakk med fibronektin (som ble oppløst i biowhittaker vann over natten ved 37 ° C ved en konsentrasjon av 1 mg i 6 ml). </li><li> Legg NCSC medium [95 DMEM/F12 ml, 1 ml Penn / Strep (P / S), 1 ml N2, 2 ml B27, 100 pl merkaptoetan...

<ol>
	<li>Cotsarelis, G., Cheng, S. Z., Dong, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Existence+of+slow-cycling+limbal+epithelial+basal+cells+that+can+be+preferentially+stimulated+to+proliferate:+implications+on+epithelial+stem+cells.">Existence of slow-cycling limbal epithelial basal cells that can be preferentially stimulated to proliferate: implications on epithelial stem cells.</a> Cell. 57, 201-209 (1989).</li><li>Cotsarelis, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-retaining+cells+reside+in+the+bulge+area+of+pilosebaceous+unit:+implications+for+follicular+stem+cells,+hair+cycle,+and+skin+carcinogenesis.">Label-retaining cells reside in the bulge area of pilosebaceous unit: implications for follicular stem cells, hair cycle, and skin carcinogenesis.</a> Cell. 61, 1329-1337 (1990).</li><li>Tanimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+follicle+stem+cells+provide+a+functional+niche+for+melanocyte+stem+cells.">Hair follicle stem cells provide a functional niche for melanocyte stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 177-187 (2011).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+novel+population+of+multipotent+adult+stem+cells+from+human+hair+follicles.">Isolation of a novel population of multipotent adult stem cells from human hair follicles.</a> Am. J. Pathol. 168, 1879-1888 (2006).</li><li>Yu, H., Kumar, S. M., Kossenkov, A. V., Showe, L., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+with+neural+crest+characteristics+derived+from+the+bulge+region+of+cultured+human+hair+follicles.">Stem cells with neural crest characteristics derived from the bulge region of cultured human hair follicles.</a> J. Invest. Dermatol. 130, 1227-1236 (2010).</li><li>Wong, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest-derived+cells+with+stem+cell+features+can+be+traced+back+to+multiple+lineages+in+the+adult+skin.">Neural crest-derived cells with stem cell features can be traced back to multiple lineages in the adult skin.</a> J. Cell Biol. 175, 1005-1015 (2006).</li><li>Sieber-Blum, M., Grim, M., Hu, Y. F., Szeder, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+neural+crest+stem+cells+in+the+adult+hair+follicle.">Pluripotent neural crest stem cells in the adult hair follicle.</a> Dev. Dyn. 231, 258-269 (2004).</li><li>Amoh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implanted+hair+follicle+stem+cells+form+Schwann+cells+that+support+repair+of+severed+peripheral+nerves.">Implanted hair follicle stem cells form Schwann cells that support repair of severed peripheral nerves.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 17734-17738 (2005).</li><li>Koliatsos, V. E., Xu, L., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell+grafts+as+therapies+for+motor+neuron+disease.">Human stem cell grafts as therapies for motor neuron disease.</a> Expert Opin. Biol. Ther. 8, 137-141 (2008).</li><li>McKenzie, I. A., Biernaskie, J., Toma, J. G., Midha, R., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin-derived+precursors+generate+myelinating+Schwann+cells+for+the+injured+and+dysmyelinated+nervous+system.">Skin-derived precursors generate myelinating Schwann cells for the injured and dysmyelinated nervous system.</a> J. Neurosci. 26, 6651-6660 (2006).</li><li>LeDouarin, N. M., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Neural Crest. , (1999).</li><li>Tumbar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+epithelial+stem+cell+niche+in+skin.">Defining the epithelial stem cell niche in skin.</a> Science. 303, 359-363 (2004).</li><li>Roh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-potentiality+of+a+new+immortalized+epithelial+stem+cell+line+derived+from+human+hair+follicles.">Multi-potentiality of a new immortalized epithelial stem cell line derived from human hair follicles.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 44, 236-244 (2008).</li></ol>

Cellen isolering og kultur som beskrives er reproduserbare og robust. Vi har generert NCSCs fra dusinvis av individer over et bredt spekter av alder. Selv om det er best å behandle vevet rett etter vev innhøsting, fant vi ut at hodebunnen vev kan trygt lagret i media på isen for overnatting transport med minimal innvirkning på celle levedyktighet. Det er viktig å behandle hodebunnen vev med antibiotika og bruke aseptisk teknikk ved hårsekken isolasjon for å unngå potensiell mikroorga...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>11965-092</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM/F12</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>11330-32</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heat-inactivated FBS</td>
 <td>Hyclone</td>
 <td>SH30071.03</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>B27 supplement</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>17504044</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>N2 supplement</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>17502048</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>bFGF</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>PHG0026</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EGF</td>
 <td>R&amp;D system</td>
 <td>236-EG-01M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IGF-I</td>
 <td>R&amp;D system</td>
 <td>291-G1-050</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.05% Trypsin/EDTA</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>25300-054</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dispase</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>17105041</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-Streptomycin</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15070063</td>
 </tr>
 </tbody> 
</table>
Table 1.

isolation and culture of neural crest stem cells from human hair follicles

Hårsekkene gjennomgå livslang vekst og hår syklusen er en godt styrt prosess som involverer stamceller spredning og ro. Hair bule er et godt karakterisert nisje for voksne stamceller en. Dette segmentet av ytre roten kappe inneholder et antall forskjellige typer av stamceller, inkludert epithelial stamceller 2, melanocyte stamceller 3 og neural crest som stamceller 4-7. Hårsekkene representerer et tilgjengelig og rik kilde for ulike typer menneskelige stamceller. Vi og andre har isolert neural crest stamceller (NCSCs) fra menneskelige foster og voksen hårsekker 4,5. Disse menneskelige stamceller plateselskap-støttemurer celler og er i stand til selvfornyelse gjennom asymmetrisk celledeling in vitro. De uttrykker umodne neural crest celle markører, men ikke differensiering markører. Vår uttrykk profilering studie viste at de deler en lignende genuttrykk mønster med murine hud umoden nevrale crest celler. De viser klonal multipotency som kan gi opphav til myogenic, melanocyttisk, og neuronal celle linjer etter in vitro klonal enkelt celle kultur. Differensierte celler ikke bare skaffe avstamning-spesifikke markører, men også demonstrere passende funksjoner i ex vivo forhold. I tillegg er disse NCSCs viser differensiering potensial mot mesenchymale linjene. Differensierte nerveceller kan vedvare i mus hjernen og beholde nevrale differensiering markører. Det har blitt vist at hårsekken utledet NCSCs kan hjelpe nerve gjenvekst, og de ​​forbedrer motorisk funksjon i mus transplantert med disse stamcellene følge transecting ryggmargsskade 8. Videre har perifere nerver blitt reparert med stamcelleforskningen grafts 9 og implantasjon av hud-avledet forløper celler ved siden knust sciatic nervene har resultert i remyelination 10. Derfor har hårsekken / hud avledet NCSCs allerede vist lovende resultater for regenerative terapi i prekliniske modeller. Somatisk celle omprogrammering til induserte pluripotente stamceller (iPS) celler har vist et enormt potensial for regenerativ medisin. Men det er fortsatt mange problemer med iPS celler, spesielt på lang sikt effekten av onkogen / virus integrering og potensielle tumorigenitet av pluripotente stamceller har ikke vært godt ivaretatt. Det er fortsatt mange hindringer som skal overvinnes før iPS celler kan brukes til regenerativ medisin. Mens voksne stamceller er kjent for å være sikker og de har blitt brukt klinisk i mange år, slik som benmargstransplantasjon. Mange pasienter har allerede dratt nytte av behandlingen. Autologe voksne stamceller er fortsatt foretrukne celler for transplantasjon. Derfor de lett tilgjengelige og kan utvides voksne stamceller i menneskelig hud / hår follicles er en verdifull kilde for regenerativ medisin.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles at JoVE.com

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Denne artikkelen presenterer en robust protokoll for isolering og kultur av neural crest stamceller fra menneskelige hårsekker.

Isolasjon og kultur av neural crest stamceller fra Human Hair Follikler

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Isolation and Culture of Human Fungiform Taste Papillae Cells

Isolering og kultur for Human Fungiform Taste papillae Cells

Taste cells are highly specialized, with unique histological, molecular and physiological characteristics that permit detection of a wide range of simple ...

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

Isolering og kultur Rat Embryonale nevrale celler: En rask protokoll

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolering og kultur neural crest Celler fra Embryonic murin Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

En cGMP-relevant Expansion Metode for Aggregater of Human Neural Stem og stamceller avledet fra pluripotent stamceller eller Fetal hjernevev

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

En mus, to kulturer: Isolation and Culture of Adult nevrale stamceller fra de to nevrogene Soner Individuell Mus

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder-free Utledning av Neural Crest stamceller fra menneskelige pluripotent stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Isolasjon og Culture of Adult Neural stamceller fra mus Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...