Name: isolation and culture of neural crest stem cells from human hair follicles
Uploaded: 2013-04-06T14:00:00
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Este trabajo es apoyado por el NIH subvención R01AR054593 y R01AR054593-S1 a Xu.

1. Preparación de placas de cultivo tisular <ol><li> Escudo cada pocillo con suficiente poli-D-lisina (PDL) para cubrir el fondo del pozo. Dejar que las placas secar en la campana. </li><li> Después de que los pozos están secos, enjuague con agua estéril y aspirar. Dejar que las placas secar en la campana. </li><li> Cuando capa seca, con fibronectina (que se disolvió en agua BioWhittaker noche a 37 º C a una concentración de 1 mg en 6 ml). </li><li> Añadir medio NCSC [95 ml de DMEM/F12, 1 ml Penn / Strep (P / ...

<ol>
	<li>Cotsarelis, G., Cheng, S. Z., Dong, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Existence+of+slow-cycling+limbal+epithelial+basal+cells+that+can+be+preferentially+stimulated+to+proliferate:+implications+on+epithelial+stem+cells.">Existence of slow-cycling limbal epithelial basal cells that can be preferentially stimulated to proliferate: implications on epithelial stem cells.</a> Cell. 57, 201-209 (1989).</li><li>Cotsarelis, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-retaining+cells+reside+in+the+bulge+area+of+pilosebaceous+unit:+implications+for+follicular+stem+cells,+hair+cycle,+and+skin+carcinogenesis.">Label-retaining cells reside in the bulge area of pilosebaceous unit: implications for follicular stem cells, hair cycle, and skin carcinogenesis.</a> Cell. 61, 1329-1337 (1990).</li><li>Tanimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+follicle+stem+cells+provide+a+functional+niche+for+melanocyte+stem+cells.">Hair follicle stem cells provide a functional niche for melanocyte stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 177-187 (2011).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+novel+population+of+multipotent+adult+stem+cells+from+human+hair+follicles.">Isolation of a novel population of multipotent adult stem cells from human hair follicles.</a> Am. J. Pathol. 168, 1879-1888 (2006).</li><li>Yu, H., Kumar, S. M., Kossenkov, A. V., Showe, L., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+with+neural+crest+characteristics+derived+from+the+bulge+region+of+cultured+human+hair+follicles.">Stem cells with neural crest characteristics derived from the bulge region of cultured human hair follicles.</a> J. Invest. Dermatol. 130, 1227-1236 (2010).</li><li>Wong, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest-derived+cells+with+stem+cell+features+can+be+traced+back+to+multiple+lineages+in+the+adult+skin.">Neural crest-derived cells with stem cell features can be traced back to multiple lineages in the adult skin.</a> J. Cell Biol. 175, 1005-1015 (2006).</li><li>Sieber-Blum, M., Grim, M., Hu, Y. F., Szeder, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+neural+crest+stem+cells+in+the+adult+hair+follicle.">Pluripotent neural crest stem cells in the adult hair follicle.</a> Dev. Dyn. 231, 258-269 (2004).</li><li>Amoh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implanted+hair+follicle+stem+cells+form+Schwann+cells+that+support+repair+of+severed+peripheral+nerves.">Implanted hair follicle stem cells form Schwann cells that support repair of severed peripheral nerves.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 17734-17738 (2005).</li><li>Koliatsos, V. E., Xu, L., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell+grafts+as+therapies+for+motor+neuron+disease.">Human stem cell grafts as therapies for motor neuron disease.</a> Expert Opin. Biol. Ther. 8, 137-141 (2008).</li><li>McKenzie, I. A., Biernaskie, J., Toma, J. G., Midha, R., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin-derived+precursors+generate+myelinating+Schwann+cells+for+the+injured+and+dysmyelinated+nervous+system.">Skin-derived precursors generate myelinating Schwann cells for the injured and dysmyelinated nervous system.</a> J. Neurosci. 26, 6651-6660 (2006).</li><li>LeDouarin, N. M., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Neural Crest. , (1999).</li><li>Tumbar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+epithelial+stem+cell+niche+in+skin.">Defining the epithelial stem cell niche in skin.</a> Science. 303, 359-363 (2004).</li><li>Roh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-potentiality+of+a+new+immortalized+epithelial+stem+cell+line+derived+from+human+hair+follicles.">Multi-potentiality of a new immortalized epithelial stem cell line derived from human hair follicles.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 44, 236-244 (2008).</li></ol>

Los métodos de aislamiento de células y cultivo descritos son reproducible y robusto. Hemos generado CTCN de docenas de individuos a través de un amplio rango de edades. Aunque es mejor para procesar el tejido justo después de la cosecha de tejidos, se encontró que los tejidos del cuero cabelludo puede ser almacenado de forma segura en los medios de comunicación sobre hielo para el transporte durante la noche con un impacto mínimo sobre la viabilidad celular. Es importante tratar el t...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>11965-092</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM/F12</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>11330-32</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heat-inactivated FBS</td>
 <td>Hyclone</td>
 <td>SH30071.03</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>B27 supplement</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>17504044</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>N2 supplement</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>17502048</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>bFGF</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>PHG0026</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EGF</td>
 <td>R&amp;D system</td>
 <td>236-EG-01M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IGF-I</td>
 <td>R&amp;D system</td>
 <td>291-G1-050</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.05% Trypsin/EDTA</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>25300-054</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dispase</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>17105041</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-Streptomycin</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15070063</td>
 </tr>
 </tbody> 
</table>
Table 1.

isolation and culture of neural crest stem cells from human hair follicles

Los folículos pilosos experimentan un crecimiento durante toda la vida y el ciclo del cabello es un proceso bien controlado que implica proliferación de células madre y la quiescencia. Bulto del pelo es un nicho bien caracterizado para las células madre adultas 1. Este segmento de la vaina radicular externa contiene un número de tipos diferentes de células madre, incluyendo células madre epiteliales, células melanocitos 2 madre 3 y de la cresta neural como las células madre 4-7. Los folículos pilosos son una fuente rica y accesible para los diferentes tipos de células madre humanas. Nosotros y otros han aislado células madre de la cresta neural (CTCN) de folículos pilosos humanos fetales y adultos 4,5. Estas células madre humanas son la etiqueta de retención de células y son capaces de auto-renovación a través de la división celular asimétrica in vitro. Ellos expresan marcadores neuronales inmaduras de células de la cresta, pero no marcadores de diferenciación. Nuestro estudio demostró que la expresión de perfiles que comparten un patrón de expresión génica similar con murino piel inmadura CRE neuralcélulas ST. Exhiben multipotencia clonal que puede dar lugar a linajes de células miogénicas, melanocíticos, y después neuronal en clonal in vitro de cultivo celular solo. Las células diferenciadas no sólo adquirir linaje marcadores específicos, sino también demostrar las funciones adecuadas en condiciones ex vivo. Además, estos CTCN mostrar potencial de diferenciación hacia linajes mesenquimales. Células neuronales diferenciadas pueden persistir en cerebro de ratón y retener marcadores neuronales de diferenciación. Se ha demostrado que el pelo del folículo derivado CTCN puede ayudar a la regeneración del nervio, y mejorar la función motora en los ratones trasplantados con estas células madre después de una lesión transección de la médula espinal 8. Además, los nervios periféricos han sido reparados con injertos de células madre 9, y la implantación de las células precursoras derivadas de la piel adyacentes a aplastadas nervios ciáticos se ha traducido en la remielinización 10. Por lo tanto, los folículos pilosos / piel CTCN derivados ya han mostrado resultados prometedores para regenerative terapia en modelos preclínicos. Reprogramación de células somáticas a madre pluripotentes inducidas (iPS) de células ha demostrado un enorme potencial para la medicina regenerativa. Sin embargo, existen todavía muchos problemas con las células iPS, en particular el efecto a largo plazo de la integración oncogén / virus y tumorigenicidad potencial de las células madre pluripotentes no han sido adecuadamente tratadas. Todavía hay muchos obstáculos que superar antes de que las células iPS pueden utilizarse para la medicina regenerativa. Mientras que las células madre adultas se sabe que son seguros y que se han usado clínicamente durante muchos años, tales como trasplante de médula ósea. Muchos pacientes se han beneficiado ya del tratamiento. Autólogo de células madre adultas son todavía células preferidas para el trasplante. Por lo tanto, las células adultas y de fácil acceso expandible madre en la piel humana / folículos pilosos son una valiosa fuente para la medicina regenerativa.

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Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

En este artículo se presenta un robusto protocolo para el aislamiento y cultivo de células de la cresta neural madre de folículos pilosos humanos.

Aislamiento y cultivo de células troncales de la cresta neural de los folículos del cabello humano

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

La producción de extracto de embrión de pollo para el Cultivo de murino crestas de células neurales madre

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent ...

Investigación

Neurociencias

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Neural formadoras de colonias ensayo de células: un ensayo para discriminar Bona Fide células troncales nerviosas de células progenitoras neurales

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Generación de las células troncales nerviosas de desechados Humanos tejido cortical fetal

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Isolation and Culture of Human Fungiform Taste Papillae Cells

Aislamiento y cultivo de células humanas las papilas fungiformes gusto

Taste cells are highly specialized, with unique histological, molecular and physiological characteristics that permit detection of a wide range of simple ...

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

Aislamiento y cultivo de células neuronales de ratas embrionarias: un protocolo rápido

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Aislamiento y cultivo de células de la cresta neural de embriones murinos del Tubo Neural

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

Un método de expansión de GMPc aplicable para agregados de Neural humano madre y células progenitoras derivadas de células madre pluripotentes o tejido cerebral fetal

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

Un ratón, dos culturas: Aislamiento y cultivo de adultos Neural las células madre de las dos zonas neurogénicos de ratones individuales

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Derivación-Feeder libres de Células Progenitoras de la cresta neural Pluripotentes Células Madre

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Aislamiento y cultivo de células madre adultas neural de la Zona subcallosal Ratón

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...