Name: experimental generation of carcinoma-associated fibroblasts (cafs) from human mammary fibroblasts
Uploaded: 2011-10-25T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts at JoVE.com

Wij danken dr. Robert A. Weinberg (Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge) voor de genereuze steun en begeleiding van dit werk en de heer Kieran Mellody (University of Manchester, Manchester), voor een kritische redactie van dit manuscript. Dit project werd ondersteund door Research Verenigd Koninkrijk (CR-VK) te verlenen nummer C147/A6058 (AO)

1. Isolatie van de primaire gekweekte menselijke normaal door de melkklieren fibroblasten Experimentele procedures voor het isoleren van primaire gekweekte menselijke fibroblasten normaal door de melkklieren worden beschreven in Fig. 1A. <ol><li> Bereid de cel dissociatie buffer, zoals eerder 12 beschreven: Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) met 10% foetaal kalf serum (FCS), penicilline-streptomycine (200 eenheden / ml), collagenase type I (1 mg / ml) en hyaluroni...

<ol>
	<li>Ronnov-Jessen, L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+by+proxy:+can+the+microenvironment+be+both+the+cause+and+consequence?.">Breast cancer by proxy: can the microenvironment be both the cause and consequence?.</a> Trends Mol. Med. 15, 5-13 (2009).</li><li>Mueller, M. M., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friends+or+foes+-+bipolar+effects+of+the+tumour+stroma+in+cancer.">Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 4, 839-849 (2004).</li><li>Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+fibroblasts+in+cancer+initiation+and+progression.">Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression.</a> Nature. 432, 332-337 (2004).</li><li>Kalluri, R., Zeisberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+in+cancer.">Fibroblasts in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).</li><li>De Wever, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tenascin-C+and+SF/HGF+produced+by+myofibroblasts+in+vitro+provide+convergent+pro-invasive+signals+to+human+colon+cancer+cells+through+RhoA+and+Rac.">Tenascin-C and SF/HGF produced by myofibroblasts in vitro provide convergent pro-invasive signals to human colon cancer cells through RhoA and Rac.</a> 18, 1016-1018 (2004).</li><li>Serini, G., Gabbiani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+myofibroblast+activity+and+phenotypic+modulation.">Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic modulation.</a> Exp. Cell. Res. 250, 273-283 (1999).</li><li>Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carcinoma-associated+fibroblasts+are+a+rate-limiting+determinant+for+tumour+progression.">Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression.</a> Semin. Cell. Dev. Biol. 21, 19-25 (2010).</li><li>Pietras, K., Ostman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+interactions+with+the+tumor+stroma.">Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma.</a> Exp. Cell. Res. 316, 1324-1331 (2010).</li><li>Polyak, K., Haviv, I., Campbell, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-evolution+of+tumor+cells+and+their+microenvironment.">Co-evolution of tumor cells and their microenvironment.</a> Trends in Genetics. 25, 30-38 (2009).</li><li>Franco, O. E., Shaw, A. K., Strand, D. W., Hayward, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+associated+fibroblasts+in+cancer+pathogenesis.">Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis.</a> Semin. Cell. Dev. Biol. 21, 33-39 (2010).</li><li>Kojima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+TGF-beta+and+stromal+cell-derived+factor-1+(SDF-1)+signaling+drives+the+evolution+of+tumor-promoting+mammary+stromal+myofibroblasts.">Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 20009-20014 (2010).</li><li>Orimo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+fibroblasts+present+in+invasive+human+breast+carcinomas+promote+tumor+growth+and+angiogenesis+through+elevated+SDF-1/CXCL12+secretion.">Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion.</a> Cell. 121, 335-348 (2005).</li></ol>

Het ontbreken van CAF-specifieke markers en de mate van heterogeniteit waargenomen bij cafe&#39;s maken de karakterisering van dit celtype een uitdaging op zich. Studeren CAFS in vitro werd ook gehinderd door de extra complicatie dat deze cellen senesce en stoppen prolifererende wanneer gekweekt voor een lange periode. Onze vorige poging om direct vereeuwigen primaire CAFS met behulp van een retrovirale hTERT cDNA construct werd geen succes. Daarom, naar aanleiding van de tumor het bevorderen van eigenschappen ...

<table border="1"><tr><td> Materiaal Naam </td><td> Type </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Commentaar </td></tr><tr><td> DMEM </td><td></td><td> Invitrogen </td><td> 61965-026 </td><td></td></tr><tr><td> Foetaal kalf serum </td><td></td><td> GIBCO </td><td> 10270 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilline-streptomycine </td><td></td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase type I </td><td></td><td> Sigma </td><td> C0130-1G </td><td></td></tr><tr><td> hyaluronidase </td><td></td><td> Sigma </td><td> H4272 </td><td></td></tr><tr><td> Vimentine (V9) antilichaam </td><td></td><td> Novocastra Laboratories </td><td> NCL-L- VIM-V9 </td><td></td></tr><tr><td> Tenascin C (BC-8) antilichaam </td><td></td><td></td><td></td><td> een geschenk van Dr. <strong&gt; Luciano Zardi </td></tr><tr><td> α-SMA-Cy3 (1A4) antilichaam </td><td></td><td> Sigma </td><td> C6198 </td><td></td></tr><tr><td> Prolyl-4-hydroxylase </td><td></td><td> Dako </td><td> M0877 </td><td></td></tr><tr><td> (5B5) antilichaam </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Collageen type 1 1A antilichaam </td><td></td><td> Sigma </td><td> HPA011795 </td><td></td></tr><tr><td> Pan-cytokeratine antilichaam </td><td></td><td> Sigma </td><td> C5992 </td><td></td></tr><tr><td> Fibronectine antilichaam </td><td></td><td> BD Biosciences </td><td> 610077 </td><td></td></tr><tr><td> S100A4/FSP-1 (fibroblast- specifiek eiwit-1) antilichaam </td><td></td><td> Dako </td><td> A5114 </td><td></td></tr><tr><td> Fibroblast oppervlakte-eiwit (Kloon 1B10) antilichaam </td><td></td><td> Abcam </td><td> ab11333 </td><td></td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> MSCV-IRES-GFP construct </td><td></td><td></td><td></td><td> Verzoek aan de de auteurs </td></tr><tr><td> pBabe-puro te bouwen </td><td></td><td></td><td></td><td> Aankoop van Addgene </td></tr><tr><td> Puromycine </td><td></td><td> Sigma </td><td> P8833 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI </td><td></td><td> Sigma </td><td> D9564 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml conische buis </td><td></td><td> Corning </td><td> 430766 </td><td></td></tr><tr><td> Naakt muis </td><td></td><td> Taconic </td><td> NCRNU-F </td><td> Vrouwelijk naakt NCR </td></tr><tr><td> C3H/10T1/2 cellen </td><td></td><td> ATCC </td><td></td><td> CCL-226 </td></tr></table>

experimental generation of carcinoma-associated fibroblasts (cafs) from human mammary fibroblasts

Carcinomen zijn complexe weefsels bestaan ​​van neoplastische cellen en een niet-kwaadaardige ruimte aangeduid als de &#39;stroma&#39;. Het stroma bestaat uit extracellulaire matrix (ECM) en een verscheidenheid van mesenchymale cellen, waaronder fibroblasten, myofibroblasten, endotheelcellen, pericyten en leukocyten 1-3. De tumor-geassocieerde stroma wordt ingespeeld op de aanzienlijke paracriene signalen uitgebracht door naburige carcinoom cellen. Tijdens het ziekteproces, het stroma wordt vaak bevolkt door carcinoma-geassocieerde fibroblasten (cafe&#39;s), inclusief een groot aantal myofibroblasten. Deze cellen zijn eerder verkregen uit veel verschillende soorten van de menselijke carcinomen voor hun in-vitro-cultuur. Een subpopulatie van cafe&#39;s is te onderscheiden door hun up-regulatie van α-gladde spiercel actine (α-SMA) expressie 4,5. Deze cellen zijn een kenmerk van &#39;geactiveerd fibroblasten&#39; die dezelfde eigenschappen delen met myofibroblasten commonly waargenomen in gewonden en fibrotische weefsels 6. De aanwezigheid van deze myofibroblastic CAF deelverzameling is sterk gerelateerd aan high-grade &#39;maligniteiten en geassocieerd met een slechte prognose bij patiënten. Veel laboratoria, inclusief onze eigen, hebben aangetoond dat de cafe&#39;s, bij injectie met een carcinoom cellen in immunodeficiënte muizen, zijn in staat om aanzienlijk te bevorderen tumorgenese 7-10. CAFS bereid uit carcinoom patiënten, echter, vaak ondergaan veroudering tijdens de voortplanting in de cultuur het beperken van de uitgebreidheid van hun gebruik in heel lopende experimenten. Om dit probleem, ontwikkelden we een nieuwe techniek om experimenteel te genereren onsterfelijke, menselijke borstklieren CAF cellijnen (exp-cafe&#39;s) uit humane fibroblasten borstklieren, met behulp van een coimplantation borsttumor xenograft model. Om de exp-cafe&#39;s, ouders menselijke fibroblasten borstklieren, verkregen uit de reductie mammoplasty weefsel te genereren, werden voor het eerst immortalised met hTERT, de katalytische subeenheid van het telomerase holoenzyme, en ontworpen om te uiten GFP en een puromycine resistentiegen. Deze cellen werden coimplanted met MCF-7 menselijke borstcarcinoom cellen die een geactiveerd ras-oncogen (MCF-7-ras-cellen) in een muis xenograft. Na een periode van incubatie in vivo, werden de aanvankelijk ingespoten mens borstklieren fibroblasten uit de tumor xenotransplantaten op basis van hun puromycine weerstand 11. Merkten we dat de bewoner menselijke fibroblasten borstklieren hebben gedifferentieerd, de aanneming van een myofibroblastic fenotype en tumor-bevorderende eigenschappen verworven in de loop van tumorprogressie. Belangrijk is dat deze cellen, gedefinieerd als exp-cafe&#39;s, op de voet na te bootsen van de tumor-bevorderende myofibroblastic fenotype van CAFS geïsoleerd van borstcarcinomen ontleed van patiënten. Onze tumor xenograft afgeleid exp-cafe&#39;s daarom voorzien in een effectief model om de biologie van CAFS studie in de mens breast carcinomen. De beschreven protocol kan ook worden uitgebreid voor het genereren en karakteriseren van de verschillende bevolkingsgroepen CAF afgeleid van andere vormen van menselijke carcinomen.

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts at JoVE.com

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoom-geassocieerde fibroblasten (cafe&#39;s), rijk aan myofibroblasten aanwezig in de tumor stroma, spelen een belangrijke rol in het besturen van tumorprogressie. We ontwikkelden een coimplantation tumor xengraft model voor het genereren van experimenteel CAFS uit humane fibroblasten borstklieren. Het protocol beschrijft hoe om vast te stellen CAF myofibroblasten dat het vermogen om tumorgenese bevorderen verwerven.

Experimentele Generatie van Carcinoom-geassocieerde fibroblasten (cafe&#39;s) van Human Borst fibroblasten

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stamceltransplantatie in een In vitro Gesimuleerde ischemie / reperfusie model

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Human Internal Mammary Artery (IMA) Transplantation and Stenting: A Human Model to Study the Development of In-Stent Restenosis

Human Internal Mammary Artery IMA Transplantation and Stenting: A Human Model to Study the Development of In-Stent Restenosis

Human Interne borstslagader (IMA) Transplantatie en stenting: een humaan model aan de ontwikkeling van in-stent restenose Studie

Preclinical in vivo research models to investigate pathobiological and pathophysiological processes in the development of intimal hyperplasia after vessel ...

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

Huid Punch Biopsie Explantatiestatus Cultuur voor Afleiding van primaire humane fibroblasten

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Het gebruik van primaire menselijke fibroblasten voor de monitoring van Mitochondriale fenotypes op het gebied van de ziekte van Parkinson

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Experimental Human Pneumococcal Carriage

Experimentele Human Pneumokokken vervoer

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Isolatie en functionele karakterisering van Human ventriculaire cardiomyocyten van Fresh Chirurgische Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular Profiling van de invasieve tumor micro in een 3-dimensionaal model van colorectale kanker cellen en<em&gt; Ex vivo</em&gt; Fibroblasts

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

Een<em&gt; Ex vivo</em&gt; Model naar Hormoon Actie studie in de menselijke borst

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Evaluatie van longmetastase in muizenborsttumorvirus Modellen van kwantitatieve real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

Weefsel karakterisering na een New Uitsplitsing Methode voor de huid Micro-Enten Generation

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...