Name: experimental generation of carcinoma-associated fibroblasts (cafs) from human mammary fibroblasts
Uploaded: 2011-10-25T12:00:00
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Wir danken Dr. Robert A. Weinberg (Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge) für die großzügige Unterstützung und Betreuung dieser Arbeit und Herrn Kieran Mellody (University of Manchester, Manchester) für kritische Bearbeitung des Manuskripts. Dieses Projekt wurde von Research UK (CR-UK) Grant-Nummer C147/A6058 (AO) unterstützt

1. Isolation von Primär-kultivierten humanen Fibroblasten normaler Brustdrüse Experimentelle Verfahren zur Isolierung von primären kultivierten humanen normalen Mamma Fibroblasten sind in Abb. dargestellt. 1A. <ol><li> Bereiten Sie die Zelle Dissoziationspuffer, wie zuvor beschrieben 12: Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Kälberserum (FCS), Penicillin-Streptomycin (200 Einheiten / ml), Kollagenase Typ I (1 mg / ml) und Hyaluronidase ( 125 Einheiten /...

<ol>
	<li>Ronnov-Jessen, L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+by+proxy:+can+the+microenvironment+be+both+the+cause+and+consequence?.">Breast cancer by proxy: can the microenvironment be both the cause and consequence?.</a> Trends Mol. Med. 15, 5-13 (2009).</li><li>Mueller, M. M., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friends+or+foes+-+bipolar+effects+of+the+tumour+stroma+in+cancer.">Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 4, 839-849 (2004).</li><li>Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+fibroblasts+in+cancer+initiation+and+progression.">Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression.</a> Nature. 432, 332-337 (2004).</li><li>Kalluri, R., Zeisberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+in+cancer.">Fibroblasts in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).</li><li>De Wever, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tenascin-C+and+SF/HGF+produced+by+myofibroblasts+in+vitro+provide+convergent+pro-invasive+signals+to+human+colon+cancer+cells+through+RhoA+and+Rac.">Tenascin-C and SF/HGF produced by myofibroblasts in vitro provide convergent pro-invasive signals to human colon cancer cells through RhoA and Rac.</a> 18, 1016-1018 (2004).</li><li>Serini, G., Gabbiani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+myofibroblast+activity+and+phenotypic+modulation.">Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic modulation.</a> Exp. Cell. Res. 250, 273-283 (1999).</li><li>Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carcinoma-associated+fibroblasts+are+a+rate-limiting+determinant+for+tumour+progression.">Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression.</a> Semin. Cell. Dev. Biol. 21, 19-25 (2010).</li><li>Pietras, K., Ostman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+interactions+with+the+tumor+stroma.">Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma.</a> Exp. Cell. Res. 316, 1324-1331 (2010).</li><li>Polyak, K., Haviv, I., Campbell, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-evolution+of+tumor+cells+and+their+microenvironment.">Co-evolution of tumor cells and their microenvironment.</a> Trends in Genetics. 25, 30-38 (2009).</li><li>Franco, O. E., Shaw, A. K., Strand, D. W., Hayward, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+associated+fibroblasts+in+cancer+pathogenesis.">Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis.</a> Semin. Cell. Dev. Biol. 21, 33-39 (2010).</li><li>Kojima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+TGF-beta+and+stromal+cell-derived+factor-1+(SDF-1)+signaling+drives+the+evolution+of+tumor-promoting+mammary+stromal+myofibroblasts.">Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 20009-20014 (2010).</li><li>Orimo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+fibroblasts+present+in+invasive+human+breast+carcinomas+promote+tumor+growth+and+angiogenesis+through+elevated+SDF-1/CXCL12+secretion.">Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion.</a> Cell. 121, 335-348 (2005).</li></ol>

Das Fehlen von CAF-spezifischen Markern und das Niveau der Heterogenität beobachtet unter CAF die Charakterisierung dieses Zelltyps eine Herausforderung an sich zu machen. Studieren CAF in vitro wurde auch durch die zusätzliche Komplikation verhindert worden, dass diese Zellen und senesce stoppen proliferierenden, wenn über einen längeren Zeitraum kultiviert. Unsere erste Anlauf, direkt verewigen primäre CAF mit einem retroviralen hTERT cDNA-Konstrukt war nicht erfolgreich. Deshalb zur weiteren Untersuchun...

<table border="1"><tr><td> Material Name </td><td> Typ </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentar </td></tr><tr><td> DMEM </td><td></td><td> Invitrogen </td><td> 61965-026 </td><td></td></tr><tr><td> Fötalem Kälberserum </td><td></td><td> GIBCO </td><td> 10270 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td></td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase Typ I </td><td></td><td> Sigma </td><td> C0130-1G </td><td></td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td></td><td> Sigma </td><td> H4272 </td><td></td></tr><tr><td> Vimentin (V9) Antikörper </td><td></td><td> Novocastra Laboratories </td><td> NCL-L- VIM-V9 </td><td></td></tr><tr><td> Tenascin C (BC-8) Antikörper </td><td></td><td></td><td></td><td> ein Geschenk von Dr. <strong&gt; Luciano Zardi </td></tr><tr><td> α-SMA-Cy3 (1A4)-Antikörper </td><td></td><td> Sigma </td><td> C6198 </td><td></td></tr><tr><td> Prolyl-4-Hydroxylase </td><td></td><td> Dako </td><td> M0877 </td><td></td></tr><tr><td> (5B5) Antikörper </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Collagen Typ1 1A-Antikörper </td><td></td><td> Sigma </td><td> HPA011795 </td><td></td></tr><tr><td> Pan-Zytokeratin Antikörper </td><td></td><td> Sigma </td><td> C5992 </td><td></td></tr><tr><td> Fibronectin Antikörper </td><td></td><td> BD Biosciences </td><td> 610077 </td><td></td></tr><tr><td> S100A4/FSP-1 (Fibroblasten- spezifisches Protein-1) Antikörper </td><td></td><td> Dako </td><td> A5114 </td><td></td></tr><tr><td> Fibroblast Oberflächenprotein (Klon 1B10) Antikörper </td><td></td><td> Abcam </td><td> ab11333 </td><td></td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> MSCV-IRES-GFP-Konstrukt </td><td></td><td></td><td></td><td> Anfrage an den die Autoren </td></tr><tr><td> pBABE-puro konstruieren </td><td></td><td></td><td></td><td> Kauf von Addgene </td></tr><tr><td> Puromycin </td><td></td><td> Sigma </td><td> P8833 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI </td><td></td><td> Sigma </td><td> D9564 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml konischen Röhrchen </td><td></td><td> Corning </td><td> 430766 </td><td></td></tr><tr><td> Nude-Maus </td><td></td><td> Taconic </td><td> NCRNU-F </td><td> Female NCr nude </td></tr><tr><td> C3H/10T1/2 Zellen </td><td></td><td> ATCC </td><td></td><td> CCL-226 </td></tr></table>

experimental generation of carcinoma-associated fibroblasts (cafs) from human mammary fibroblasts

Karzinome sind komplexe Gewebe von neoplastischen Zellen und einer nicht krebsartigen Fach bezeichnet als &quot;Stroma&quot; zusammen. Das Stroma besteht aus der extrazellulären Matrix (ECM) und eine Vielzahl von mesenchymalen Zellen, einschließlich Fibroblasten, Myofibroblasten, Endothelzellen, Perizyten und Leukozyten 1-3. Der Tumor-assoziierten Stroma reagiert auf erhebliche parakrine Signale von benachbarten Krebszellen freigesetzt. Während des Krankheitsverlaufs, das Stroma wird oft von Karzinom-assoziierte Fibroblasten (CAF), einschließlich einer großen Anzahl von Myofibroblasten besiedelt. Diese Zellen haben bisher von vielen verschiedenen Arten von humanen Karzinomen wurden für ihre in-vitro-Kultur extrahiert. Eine Subpopulation von CAF unterscheidet sich durch ihre Hochregulation von α-smooth muscle actin (α-SMA) Ausdruck 4,5. Diese Zellen sind ein Markenzeichen der &quot;aktivierten Fibroblasten&quot;, die ähnliche Eigenschaften teilen mit Myofibroblasten commonly in verletzten und fibrotische Gewebe 6 beobachtet. Das Vorhandensein dieser myofibroblastischer CAF Teilmenge ist sehr zu hochwertigen Malignomen im Zusammenhang und in Verbindung mit schlechten Prognosen bei Patienten. Viele Laboratorien, einschließlich unserer eigenen, haben gezeigt, dass CAF, wenn sie mit Karzinom-Zellen in immundefizienten Mäusen injiziert, der fähig ist wesentlich fördern Tumorgenese 7-10 sind. CAF von Karzinom-Patienten vorbereitet, jedoch häufig zu unterziehen Seneszenz bei der Ausbreitung in der Kultur Begrenzung des Umfangs ihres Einsatzes im gesamten laufenden Experimente. Zur Überwindung dieser Schwierigkeit, entwickelten wir eine neuartige Technik experimentell zu erzeugen immortalisierten humanen Mamma-CAF-Zelllinien (exp-CAF) aus menschlichen Brustkrebszellen Fibroblasten mit einem coimplantation Brusttumor Xenograftmodell. Um exp-CAF, Kindersicherung menschlichen Brustdrüse Fibroblasten, aus der Reduktion mammoplasty Gewebe gewonnen zu generieren, wurden zuerst immortalised mit hTERT, der katalytischen Untereinheit der Telomerase Holoenzym, und ausgeführt, um auszudrücken GFP und ein Puromycin-Resistenzgen. Diese Zellen wurden mit humanen MCF-7 Brustkrebs-Zellen, die einen aktivierten Ras-Onkogen (MCF-7-ras-Zellen) in eine Maus-Xenograft coimplanted. Nach einer Inkubationszeit in vivo wurden die ursprünglich injizierten menschlichen Brustdrüse Fibroblasten aus dem Tumorxenotransplantaten auf der Grundlage ihrer Puromycin-Resistenz 11 entnommen. Wir beobachten, dass die Bewohner menschlichen Brustdrüse Fibroblasten differenziert, die Annahme eines myofibroblastischer Phänotyp und erwarb Tumor-fördernden Eigenschaften im Laufe der Tumorprogression. Wichtig ist, dass diese Zellen, definiert als exp-CAF, imitieren tumorpromovierende myofibroblastischer Phänotyp der CAF von Mammakarzinomen von Patienten seziert isoliert. Unsere Tumorxenotransplantates-derived exp-CAF daher ein wirksames Modell, um die Biologie des CAF in menschlichen Breas Studiet Karzinome. Das beschriebene Protokoll kann auch zur Erzeugung und Charakterisierung von verschiedenen CAF Populationen von anderen Typen von humanen Karzinomen abgeleitet erweitert werden.

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Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Karzinom-assoziierte Fibroblasten (CAF) reichen in Myofibroblasten innerhalb des Tumorstroma, spielen eine wichtige Rolle bei der Vertreibung der Tumorprogression. Wir entwickelten ein coimplantation Tumor xengraft Modell für experimentell erzeugen CAF von der menschlichen Brustdrüse Fibroblasten. Das Protokoll beschreibt, wie CAF Myofibroblasten, dass die Fähigkeit zur Tumorentstehung fördern erwerben zu etablieren.

Experimentelle Erzeugung von Karzinom-assoziierte Fibroblasten (CAF) von menschlichen Brustkrebszellen Fibroblasten

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

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Medizin

Human Internal Mammary Artery (IMA) Transplantation and Stenting: A Human Model to Study the Development of In-Stent Restenosis

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Menschliche Arteria mammaria interna (IMA) Transplantation und Stenting: A Human Model um die Entwicklung von In-Stent Restenose Studie

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Haut Stanzbiopsie Explantatkultur für die Ableitung des primären humanen Fibroblasten

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The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Die Verwendung von primären humanen Fibroblasten zur Überwachung Mitochondriale Phänotypen auf dem Gebiet der Parkinson-Krankheit

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Experimental Human Pneumococcal Carriage

Experimentelle Menschliche Pneumokokken Carriage

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Isolierung und funktionelle Charakterisierung der Menschen ventrikuläre Kardiomyozyten von Fresh Chirurgische Proben

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Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular Profiling von der invasiven Tumor-Microenvironment in einem 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells und<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Fibroblasten

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

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Ein<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Modell um die Hormonwirkung in der menschlichen Brust Studieren

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

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Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

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