Name: experimental generation of carcinoma-associated fibroblasts (cafs) from human mammary fibroblasts
Uploaded: 2011-10-25T12:00:00
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Ringraziamo il Dr. Robert A. Weinberg (Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge) per il generoso sostegno e la supervisione di questo lavoro e il Sig. Kieran Mellody (Università di Manchester, Manchester) per la modifica critica di questo manoscritto. Questo progetto è stato sostenuto da Research UK (CR-UK) concedere numero C147/A6058 (AO)

1. Isolamento di fibroblasti umani in coltura primaria mammaria normale Procedure sperimentali per isolare fibroblasti umani in coltura primaria mammaria normale, sono illustrate nella fig. 1A. <ol><li> Preparare il tampone di cellule dissociazione, come descritto in precedenza 12: Media Dulbecco Modified Eagle (DMEM) con 10% di siero fetale bovino (FCS), penicillina-streptomicina (200 unità / ml), collagenasi di tipo I (1 mg / ml) e ialuronidasi ( 125 unità / ml). </li><li> L...

<ol>
	<li>Ronnov-Jessen, L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+by+proxy:+can+the+microenvironment+be+both+the+cause+and+consequence?.">Breast cancer by proxy: can the microenvironment be both the cause and consequence?.</a> Trends Mol. Med. 15, 5-13 (2009).</li><li>Mueller, M. M., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friends+or+foes+-+bipolar+effects+of+the+tumour+stroma+in+cancer.">Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 4, 839-849 (2004).</li><li>Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+fibroblasts+in+cancer+initiation+and+progression.">Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression.</a> Nature. 432, 332-337 (2004).</li><li>Kalluri, R., Zeisberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+in+cancer.">Fibroblasts in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).</li><li>De Wever, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tenascin-C+and+SF/HGF+produced+by+myofibroblasts+in+vitro+provide+convergent+pro-invasive+signals+to+human+colon+cancer+cells+through+RhoA+and+Rac.">Tenascin-C and SF/HGF produced by myofibroblasts in vitro provide convergent pro-invasive signals to human colon cancer cells through RhoA and Rac.</a> 18, 1016-1018 (2004).</li><li>Serini, G., Gabbiani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+myofibroblast+activity+and+phenotypic+modulation.">Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic modulation.</a> Exp. Cell. Res. 250, 273-283 (1999).</li><li>Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carcinoma-associated+fibroblasts+are+a+rate-limiting+determinant+for+tumour+progression.">Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression.</a> Semin. Cell. Dev. Biol. 21, 19-25 (2010).</li><li>Pietras, K., Ostman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+interactions+with+the+tumor+stroma.">Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma.</a> Exp. Cell. Res. 316, 1324-1331 (2010).</li><li>Polyak, K., Haviv, I., Campbell, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-evolution+of+tumor+cells+and+their+microenvironment.">Co-evolution of tumor cells and their microenvironment.</a> Trends in Genetics. 25, 30-38 (2009).</li><li>Franco, O. E., Shaw, A. K., Strand, D. W., Hayward, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+associated+fibroblasts+in+cancer+pathogenesis.">Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis.</a> Semin. Cell. Dev. Biol. 21, 33-39 (2010).</li><li>Kojima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+TGF-beta+and+stromal+cell-derived+factor-1+(SDF-1)+signaling+drives+the+evolution+of+tumor-promoting+mammary+stromal+myofibroblasts.">Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 20009-20014 (2010).</li><li>Orimo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+fibroblasts+present+in+invasive+human+breast+carcinomas+promote+tumor+growth+and+angiogenesis+through+elevated+SDF-1/CXCL12+secretion.">Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion.</a> Cell. 121, 335-348 (2005).</li></ol>

La mancanza di CAF-specifici marcatori e il livello di eterogeneità osservata tra CAF rendere la caratterizzazione di questo tipo di cellule una sfida in sé. CAF studio in vitro è stato ostacolato dalla complicazione ulteriore che queste cellule senesce e fermare la proliferazione quando in coltura per un lungo periodo. Il nostro precedente tentativo di immortalare direttamente CAF primaria utilizzando un costrutto retrovirale hTERT cDNA non ha avuto successo. Pertanto, per approfondire lo studio del tumore ...

<table border="1"><tr><td> Nome del materiale </td><td> Tipo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commento </td></tr><tr><td> DMEM </td><td></td><td> Invitrogen </td><td> 61965-026 </td><td></td></tr><tr><td> Siero di vitello fetale </td><td></td><td> GIBCO </td><td> 10270 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina-streptomicina </td><td></td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenasi tipo I </td><td></td><td> Sigma </td><td> C0130-1G </td><td></td></tr><tr><td> ialuronidasi </td><td></td><td> Sigma </td><td> H4272 </td><td></td></tr><tr><td> Vimentina (V9) anticorpi </td><td></td><td> Novocastra Laboratori </td><td> NCL-L- VIM-V9 </td><td></td></tr><tr><td> Tenascina C (AC-8) anticorpi </td><td></td><td></td><td></td><td> un dono di Dr. <strong&gt; Luciano Zardi </td></tr><tr><td> α-SMA-Cy3 (1A4) anticorpi </td><td></td><td> Sigma </td><td> C6198 </td><td></td></tr><tr><td> Prolil-4-idrossilasi </td><td></td><td> Dako </td><td> M0877 </td><td></td></tr><tr><td> (5B5) anticorpi </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Collagene tipo1 1A anticorpi </td><td></td><td> Sigma </td><td> HPA011795 </td><td></td></tr><tr><td> Pan-citocheratina anticorpi </td><td></td><td> Sigma </td><td> C5992 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpi fibronectina </td><td></td><td> BD Biosciences </td><td> 610077 </td><td></td></tr><tr><td> S100A4/FSP-1 (fibroblasti- proteina-1 specifica) degli anticorpi </td><td></td><td> Dako </td><td> A5114 </td><td></td></tr><tr><td> Fibroblasti superficie proteica (Clone 1B10) anticorpi </td><td></td><td> Abcam </td><td> ab11333 </td><td></td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> MSCV-IRES-GFP costruire </td><td></td><td></td><td></td><td> Richiesta ai autori </td></tr><tr><td> pBabe-puro costruire </td><td></td><td></td><td></td><td> Acquisto da Addgene </td></tr><tr><td> Puromicina </td><td></td><td> Sigma </td><td> P8833 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI </td><td></td><td> Sigma </td><td> D9564 </td><td></td></tr><tr><td> Tubo 15 ml conica </td><td></td><td> Corning </td><td> 430766 </td><td></td></tr><tr><td> Topo nudo </td><td></td><td> Taconic </td><td> NCRNU-F </td><td> NCR nudo femminile </td></tr><tr><td> C3H/10T1/2 cellule </td><td></td><td> ATCC </td><td></td><td> CCL-226 </td></tr></table>

experimental generation of carcinoma-associated fibroblasts (cafs) from human mammary fibroblasts

I carcinomi sono i tessuti complesso composto di cellule neoplastiche e non-cancerosa comparto denominato &#39;stroma&#39;. Lo stroma è costituito da matrice extracellulare (ECM) e una varietà di cellule mesenchimali, tra cui fibroblasti, miofibroblasti, cellule endoteliali, periciti e leucociti 1-3. Il tumore-associati stroma è sensibile a sostanziali segnali paracrini rilasciati da cellule di carcinoma vicine. Durante il processo della malattia, lo stroma diventa spesso popolato da carcinoma associato fibroblasti (CAF), tra cui un gran numero di miofibroblasti. Queste cellule sono stati precedentemente estratti da diversi tipi di carcinomi umani per la loro cultura in vitro. Una sottopopolazione di CAF si distingue attraverso la loro up-regulation di α-actina del muscolo liscio (α-SMA) espressione 4,5. Queste cellule sono un marchio di garanzia &#39;fibroblasti attivati&#39; che condividono proprietà similari con miofibroblasti commonly osservato nei tessuti fibrotici feriti e 6. La presenza di questo sottoinsieme myofibroblastic CAF è fortemente legate ad alto grado di malignità e associata a prognosi non favorevole nei pazienti. Molti laboratori, compreso il nostro, hanno dimostrato che la CAF, una volta iniettato con cellule di carcinoma in topi immunodeficienti, sono in grado di promuovere sostanzialmente tumorigenesi 7-10. CAF preparato da pazienti carcinoma, però, frequentemente sottoposti a senescenza durante la propagazione della cultura limitare la vastità del loro utilizzo per tutta la sperimentazione in corso. Per superare questa difficoltà, abbiamo sviluppato una nuova tecnica per generare sperimentalmente immortalato umano mammario linee cellulari CAF (exp-CAF) da fibroblasti umani mammari, utilizzando un modello di tumore al seno coimplantation xenotrapianto. Al fine di generare exp-CAF, dei genitori fibroblasti umani mammari, ottenute dal tessuto mastoplastica riduttiva, sono stati Immortalised con hTERT, la subunità catalitica della telomerasi oloenzima, e progettato per esprimere la GFP e un gene di resistenza puromicina. Queste cellule sono state coimplanted con cellule MCF-7 di carcinoma mammario umano esprime un oncogene attivato ras (MCF-7-ras cellule) in caso di trapianto di mouse. Dopo un periodo di incubazione in vivo, inizialmente iniettato fibroblasti umani mammari sono stati estratti dal xenotrapianti tumorali sulla base della loro resistenza puromicina 11. Abbiamo osservato che il residente fibroblasti umani mammari hanno differenziato, l&#39;adozione di un fenotipo tumorale myofibroblastic e acquisiti di promozione proprietà nel corso della progressione del tumore. È importante sottolineare che queste cellule, definite come exp-CAF, in stretta imitare il tumore di promozione fenotipo myofibroblastic del CAF isolate da carcinomi del seno sezionato dai pazienti. Il nostro tumore xenotrapianto-derivato exp-CAF quindi fornire un modello efficace per studiare la biologia del CAF in BREAS umanot carcinomi. Il protocollo descritto può essere esteso anche per la generazione e la caratterizzazione varie popolazioni CAF derivate da altri tipi di carcinomi umani.

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Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma associato fibroblasti (CAF), ricco di miofibroblasti presenti nello stroma del tumore, svolgono un ruolo importante nel guidare la progressione del tumore. Abbiamo sviluppato un tumore modello coimplantation xengraft per generare sperimentalmente CAF da fibroblasti umani mammaria. Il protocollo descrive come stabilire miofibroblasti CAF che acquisiscono la capacità di promuovere la tumorigenesi.

Generazione sperimentale di carcinoma-Associated fibroblasti (CAF) da fibroblasti umani mammari

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Research

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Medicine

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