Name: experimental generation of carcinoma-associated fibroblasts (cafs) from human mammary fibroblasts
Uploaded: 2011-10-25T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts at JoVE.com

我々は、この原稿の重大な編集にはこの作業の寛大な支援と監督のロバートA.ワインバーグ（ホワイトヘッドバイオ医療研究所、ケンブリッジ）と氏キーランMellody（マンチェスター大学、マンチェスターの）感謝。このプロジェクトは、研究英国（CR -英国）承認番号C147/A6058（AO）によってサポートされていました

1。初代培養ヒト正常乳腺線維芽細胞の分離初代培養ヒト正常乳腺線維芽細胞を単離するための実験手順を図で説明されています。 1A。 <ol><li>以前に12を説明するように、細胞解離バッファーを準備します：10％ウシ胎児血清（FCS）、ペニシリン-ストレプトマイシン（200単位/ ml）、コラゲナーゼタイプI（1 mg / ml）を、ヒアルロニダーゼ（とダルベッコ変法イー?...

<ol>
	<li>Ronnov-Jessen, L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+by+proxy:+can+the+microenvironment+be+both+the+cause+and+consequence?.">Breast cancer by proxy: can the microenvironment be both the cause and consequence?.</a> Trends Mol. Med. 15, 5-13 (2009).</li><li>Mueller, M. M., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friends+or+foes+-+bipolar+effects+of+the+tumour+stroma+in+cancer.">Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 4, 839-849 (2004).</li><li>Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+fibroblasts+in+cancer+initiation+and+progression.">Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression.</a> Nature. 432, 332-337 (2004).</li><li>Kalluri, R., Zeisberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+in+cancer.">Fibroblasts in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).</li><li>De Wever, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tenascin-C+and+SF/HGF+produced+by+myofibroblasts+in+vitro+provide+convergent+pro-invasive+signals+to+human+colon+cancer+cells+through+RhoA+and+Rac.">Tenascin-C and SF/HGF produced by myofibroblasts in vitro provide convergent pro-invasive signals to human colon cancer cells through RhoA and Rac.</a> 18, 1016-1018 (2004).</li><li>Serini, G., Gabbiani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+myofibroblast+activity+and+phenotypic+modulation.">Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic modulation.</a> Exp. Cell. Res. 250, 273-283 (1999).</li><li>Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carcinoma-associated+fibroblasts+are+a+rate-limiting+determinant+for+tumour+progression.">Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression.</a> Semin. Cell. Dev. Biol. 21, 19-25 (2010).</li><li>Pietras, K., Ostman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+interactions+with+the+tumor+stroma.">Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma.</a> Exp. Cell. Res. 316, 1324-1331 (2010).</li><li>Polyak, K., Haviv, I., Campbell, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-evolution+of+tumor+cells+and+their+microenvironment.">Co-evolution of tumor cells and their microenvironment.</a> Trends in Genetics. 25, 30-38 (2009).</li><li>Franco, O. E., Shaw, A. K., Strand, D. W., Hayward, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+associated+fibroblasts+in+cancer+pathogenesis.">Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis.</a> Semin. Cell. Dev. Biol. 21, 33-39 (2010).</li><li>Kojima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+TGF-beta+and+stromal+cell-derived+factor-1+(SDF-1)+signaling+drives+the+evolution+of+tumor-promoting+mammary+stromal+myofibroblasts.">Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 20009-20014 (2010).</li><li>Orimo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+fibroblasts+present+in+invasive+human+breast+carcinomas+promote+tumor+growth+and+angiogenesis+through+elevated+SDF-1/CXCL12+secretion.">Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion.</a> Cell. 121, 335-348 (2005).</li></ol>

CAF -特異的マーカーとCAFSの間で観察された不均質性のレベルの欠如は、この細胞型自体の課題の特性評価をレンダリングする。 in vitroで研究するCAFSはまた、これらの細胞が老化し、長期間培養すると増殖が停止する追加の合併症によって妨げられている。直接レトロウイルステロメラーゼcDNA構築物を使用して、プライマリCAFSをimmortaliseに私たちの以前の試みは失敗しました。したが?...

<table border="1"><tr><td> 材料名 </td><td> タイプ </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> DMEM </td><td></td><td>インビトロジェン</td><td> 61965-026 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td></td><td> GIBCO </td><td> 10270 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td></td><td>インビトロジェン</td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼI型</td><td></td><td>シグマ</td><td> C0130 - 1G </td><td></td></tr><tr><td>ヒアルロニダーゼ</td><td></td><td>シグマ</td><td> H4272 </td><td></td></tr><tr><td>ビメンチン（V9）抗体</td><td></td><td> Novocastra研究所</td><td> NCL - L - VIM - V9 </td><td></td></tr><tr><td>テネイシンC（BC - 8）抗体</td><td></td><td></td><td></td><td>からの贈り物 博士<stroNG&gt;ルチアーノ Zardi </td></tr><tr><td> α- SMA - Cy3の（1A4）抗体</td><td></td><td>シグマ</td><td> C6198 </td><td></td></tr><tr><td>プロリル-4 - ヒドロキシラーゼ</td><td></td><td> Dako社製</td><td> M0877 </td><td></td></tr><tr><td> （5B5）抗体</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>コラーゲンタイプ1の1A抗体</td><td></td><td>シグマ</td><td> HPA011795 </td><td></td></tr><tr><td>汎サイトケラチン抗体</td><td></td><td>シグマ</td><td> C5992 </td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチン抗体</td><td></td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 610077 </td><td></td></tr><tr><td> S100A4/FSP-1（線維芽細胞特定のタンパク質- 1）抗体</td><td></td><td> Dako社製</td><td> A5114 </td><td></td></tr><tr><td>線維芽細胞表面タンパク質 （クローン1B10）抗体</td><td></td><td>アブカム</td><td> ab11333 </td><td></td> &lt;/ TR&gt; <tr><td> MSCV - IRES - GFPコンストラクト</td><td></td><td></td><td></td><td>作家へのお願い</td></tr><tr><td> pBabe -プーロ構造</td><td></td><td></td><td></td><td>購入 Addgeneから</td></tr><tr><td>ピューロマイシン</td><td></td><td>シグマ</td><td> P8833 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI </td><td></td><td>シグマ</td><td> D9564 </td><td></td></tr><tr><td> 15 mlコニカルチューブ</td><td></td><td>コー​​ニング</td><td> 430766 </td><td></td></tr><tr><td>ヌードマウス</td><td></td><td>タコ</td><td> NCRNU - F </td><td>女性のNCRヌード</td></tr><tr><td> C3H/10T1/2細胞</td><td></td><td> ATCC </td><td></td><td> CCL - 226 </td></tr></table>

experimental generation of carcinoma-associated fibroblasts (cafs) from human mammary fibroblasts

癌は、腫瘍細胞と&quot;質&quot;と呼ばれる非癌コンパートメントで構成される複雑な組織です。間質は、細胞外マトリックス（ECM）と1-3線維芽細胞、筋線維芽細胞、内皮細胞、周皮細胞と白血球を含む間葉系細胞が、様々な構成されています。 腫瘍関連間質には、近隣の癌細胞から放出される実質的なパラクリン信号に応答する。病気のプロセスの間、間質は、しばしば筋線維芽細胞の多数を含む、癌関連線維芽細胞（CAFS）によって人口になります。これらの細胞は、以前はそれらのin vitroでの培養のためのヒト癌の多くの異なる種類から抽出されています。 CAFSの亜集団は、4,5、そのα-平滑筋アクチンのアップレギュレーション（α- SMA）の発現を介して識別可能である。これらの細胞は、筋線維芽細胞Cと同様の性質を共有する&quot;活性化線維芽細胞&quot;の特徴です。ommonly負傷したと線維性組織6で観察された。この筋線維芽CAFのサブセットの存在は非常に高品位な悪性腫瘍に関連し、患者の予後不良に関連付けられています。 私たち自身を含む多くの研究室では、、CAFS、免疫不全マウスに癌細胞を注入、大幅に腫瘍形成7-10を促進することができることが示されている。癌患者から調製CAFSは、しかし、頻繁に継続的な実験を通してそれらの使用の広範さを制限する文化の伝播中に老化を受ける。この困難を克服するために、我々はcoimplantationの乳房の腫瘍の異種移植モデルを用いて、実験的にヒト乳腺線維芽細胞から不死化したヒト乳腺CAF細胞株を（EXP - CAFS）を生成するための新しい技術を開発。 EXP - CAFSを生成するためには、リダクションの乳房形成組織から得られた親のヒト乳腺線維芽細胞は、最初immortaliいたテロメラーゼ、テロメラーゼホロ酵素の触媒サブユニット、およびGFPを発現し、ピューロマイシン耐性遺伝子に設計さとSED。これらの細胞は、マウス異種移植に活性化rasがん遺伝子（MCF - 7 - rasの細胞）を発現するMCF - 7ヒト乳癌細胞でcoimplantedていた。 in vivoでのインキュベーション期間の後、最初に注入されたヒト乳腺線維芽細胞は、それらのピューロマイシン耐性11に基づいて腫瘍の異種移植片から抽出された。 我々は、筋線維芽細胞表現型を採用し、常駐ヒト乳腺線維芽細胞が分化したことを観察し、腫瘍の進行の過程で腫瘍促進特性を取得した。重要なことは、これらの細胞は、EXP - CAFSとして定義されて、密接に患者から切除した乳癌から分離されたCAFSの腫瘍促進筋線維芽細胞表現型を模倣する。私たちの腫瘍異種移植片由来のEXP - CAFSしたがって人間breasでCAFSの生物学を研究するために効果的なモデルを提供tの癌。記述されたプロトコルはまた、ヒト癌の他の型から派生した様々なCAFの集団を生成し、特徴付けるために延長することができる。

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts at JoVE.com

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

腫瘍間質内に存在する筋線維芽細胞の豊富な癌関連線維芽細胞（CAFS）、腫瘍の進行を推進する上で重要な役割を果たす。我々は実験的にヒト乳腺線維芽細胞からCAFSを生成するためのcoimplantation腫瘍xengraftモデルを開発した。プロトコルは、腫瘍形成を促進する能力を身CAFの筋線維芽細胞を確立する方法について説明します。

ヒト乳腺線維芽細胞からの癌関連線維芽細胞の実験的生成（CAFS）

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

における幹細胞移植 in vitroで模擬虚血/再灌流モデル

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Human Internal Mammary Artery (IMA) Transplantation and Stenting: A Human Model to Study the Development of In-Stent Restenosis

Human Internal Mammary Artery IMA Transplantation and Stenting: A Human Model to Study the Development of In-Stent Restenosis

人間の内胸動脈（IMA）移植およびステント留置術：ステント内再狭窄の開発を研究するための人体モデル

Preclinical in vivo research models to investigate pathobiological and pathophysiological processes in the development of intimal hyperplasia after vessel ...

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

プライマリーヒト線維芽細胞の導出のために皮膚パンチ生検植文化

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

パーキンソン病の分野におけるミトコンドリアの表現型を監視するための主要ヒト線維芽細胞の使用

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Experimental Human Pneumococcal Carriage

実験的な人間の肺炎球菌キャリッジ

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

離と新鮮な外科的試料からのヒト心室の心筋細胞の機能解析

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

大腸癌細胞の3次元モデルにおける侵襲性腫瘍微小環境の分子プロファイリングと<em&gt;生体外</em&gt;線維芽細胞

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

アン<em&gt;エクスビボ</emヒト乳癌でホルモンの作用を研究するために&gt;モデル

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

定量的リアルタイムPCRによるマウス乳腺腫瘍モデルにおける肺転移の評価

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

スキンマイクログラフト世代の新しい脱凝集法後の組織性状

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...